毛德倩 楊曉光 牟維鵬 中國預防醫學(xué)科學(xué)院營(yíng)養與食品衛生研究所
　　摘要：本文描述了采用PCR（聚合酶鏈式反映） 方法來(lái)檢測轉基因玉米和大豆中GMO（遺傳修飾物質(zhì)）的方法。檢測的步驟包括：（1）玉米和大豆基因組DNA的提取；（2）對轉入的35s啟動(dòng)子和NOS終止子利用PCR方法進(jìn)行擴增；（3）對玉米和大豆的特異性基因進(jìn)行PCR擴增，以確定確實(shí)是玉米和大豆；（4）利用瓊脂糖凝膠電泳及酶切方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行描述與確認。
　　關(guān)鍵詞： PCR， Bt-176玉米， Round-up Ready 大豆（RR大豆），基因修飾物質(zhì)（GMO）
　　
　　前言： 自FLAVR SAVR西紅柿在美國進(jìn)入市場(chǎng)后，現在已經(jīng)有許多的轉基因作物及其產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)，同時(shí)，其安全性問(wèn)題也越來(lái)越引起消費者的重視。在一項調查中，大約有50%的被訪(fǎng)人員表示不會(huì )食用轉基因食品，而只有2%的被訪(fǎng)人員表示會(huì )無(wú)條件的食用。利用標簽對轉基因食品進(jìn)行說(shuō)明是一個(gè)解決消費者憂(yōu)慮的方法，當有135個(gè)國家在2000年1月對此已達成協(xié)議。如歐盟規定，食品中GMO的含量如果超過(guò)1%，就必須在標簽上做出標示。，必須對食品中的GMO進(jìn)行檢測。
　　現在，對食品中的GMO的檢測大都采用PCR方法。由于大多的轉基因食品的基因都含有CaMV35s啟動(dòng)子和/或NOS終止子，因此，在檢測食品中是否含有GMO時(shí)，可直接檢測CaMV35s 啟動(dòng)子或NOS終止子的存在與否，如果存在， 即可說(shuō)明其中存在GMO。

1、材用和方法
　　1.1樣品：Bt-176玉米 0%， 0.1%， 0.5% 2%
　　Round-up Ready大豆 0%, 0.1%, 1% 2%

　　1.1.1 樣品處理：DNA的提取：利用CTAB方法進(jìn)行DNA的提取，用Promega公司的DNA純化試劑盒對提取出的DNA進(jìn)行純化，最后得到50μl的DNA溶液， 保存于-20℃。
　　1.1.2 PCR擴增：
　　引物
　　35S-1: 5’ –GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3’
　　35S-2: 5’ –GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’
　　NOS-1: 5’ –GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3’
　　NOS-4: 5’ –GAT TGA ATC CTG TTG CCG GT-3’
　　NOS-5: 5’ –GTA ACA TAG ATG ACA CCG CG-3’
　　NOS-6: 5’ –CCC ATC TCA TAA ATA ACG TC-3’
　　IVR-1: 5’ –CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3’
　　IVR-2: 5’ –GAT CGT CAT GCT CTA CAC GGG CTC C-3’
　　LEC-1: 5’ –TGC CGA AGC AAC CAA ACA TGA TCC T-3’
　　LEC-2: 5’ –TGA TGG ATC TGA TAG AAT TGA CGT T-3’

(1) 對35s進(jìn)行擴增：
　　首先配制反應液，每個(gè)反應管45μl反應液，再加入5μl的DNA溶液： PCR擴增條件：預熱，98℃，2分；降解，95℃，30秒；退火，54℃，40秒；延伸，72℃，40秒；40個(gè)循環(huán)，最后延伸，72℃，3分；保存，4℃，15分。
　　PCR結束后，離心數秒，各取10μl的PCR產(chǎn)物，加入2μl的顯色劑，混勻，利用瓊脂糖疑膠（2%w/v）電泳進(jìn)行檢測，電泳結果利用紫外成相儀進(jìn)行觀(guān)察。
　　利用限制性?xún)惹忻笇?5s啟動(dòng)子進(jìn)行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對電泳結果利用紫外成相儀進(jìn)行觀(guān)察。
（2） 利用雀巢PCR法對NOS終止子進(jìn)行擴增：
　　配制第一次PCR的反應液，與CaMV35s的反應液的配制方法相同，只是將引物更換為NOS-4和NOS-5。進(jìn)行PCR擴增。 配制第二次PCR的反應液，每一管48μl，加入2μl的第一次PCR擴增產(chǎn)物： PCR結束后，離心數秒，各取10μl產(chǎn)物與2μl的顯色劑混勻，利用瓊脂糖凝膠（2% w/v）電泳進(jìn)行檢測，電泳結果利用紫外成相儀進(jìn)行觀(guān)察。
(3) 玉米和大豆特異性檢測：
　　我們所用的基因為IVR基因，是玉米的特異性基因，反應液的配制：與CaMV35s的反應液配制方法節相同，所加引物為IVR-1和IVR-2，最后加入5.0μl的玉米DNA。
　　PCR結束后，離心數秒。各取10μl，加入2μl的顯色劑，混勻，之廳凝膠電泳。
　　大豆特異性基因為L(cháng)EC基因，大豆PCR反應液的配制和CaMV35s的反應液配制方法相同，所用引物為L(cháng)EC-1和LEC-2，最后加入5.0ul的大豆DNA，
　　PCR結束后，離心數秒，各取10μl，加入2μl的顯色劑，混勻，進(jìn)行凝膠電泳。

2、結果與討論
　　 PCR是整個(gè)程序中的一個(gè)必要的部分，PCR方法已經(jīng)發(fā)展的比較成熟，已常規應用于分子生物學(xué)，并且已越來(lái)越多的應用于食品分析。但每一種檢測轉基因食品的方法都需要考慮一些特殊的情況，如從食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制劑，DNA的降解，可能存在的RNA，以及選擇合適的靶序列的引物來(lái)保證擴增的成功等。
2.1DNA的提取
　　DNA的提取是此檢測方法中的關(guān)鍵的一步，其效率高低直接決定著(zhù)后面PCR的成功與否。這種方法已經(jīng)應用于Bt-176玉米的檢測，本方法與它的方法有許多不同之處。在玉米和大豆中存在的大量淀粉及其他形式的多糖，有可能是DNA聚合酶的抑制劑。DNA提取出來(lái)以后，采用Promega公司的植物基因組DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。
2.2 PCR擴增
　　Bt-176玉米和RR大豆中的CaMV35s啟動(dòng)子來(lái)自于花椰菜病毒，NOS終止子來(lái)自于土壤中菌屬的胭脂氨酸合酶基因，許多轉基因作物都采用CaMV35s啟動(dòng)子來(lái)促進(jìn)轉入基因片段的表達，而采用 NOS終止子來(lái)結束轉入基因的轉錄。本研究所采用的Bt-176玉米以及RR大豆都含有CaMV35s啟動(dòng)子，而RR大豆還含有NOS終止子，Bt-176玉米不含有NOS終止子。 CaMV35s啟動(dòng)子是一段長(cháng)195bp的堿基序列，如圖l和圖2所示，經(jīng)過(guò)PCR擴增以后，在凝膠電泳檢測中，其條帶位置在200bp左右。圖1中2，3，4泳道中RR大豆的含量分別0.1%，1%和2%，條帶亮度依次增強；圖2中2，3，4泳道中Bt-176玉米的含量分別為0.1%，0.5%，2%，條帶亮度依次增強。但兩圖中0泳道中也都出現了相同的條帶，這是CaMV35s啟動(dòng)子擴增時(shí)出現的非特異性條帶，因此，35s 最終確定需要利用限制性?xún)惹忻竵?lái)進(jìn)行酶切。 NOS終止子經(jīng)過(guò)雀巢PCR擴增以后，為一段104bp的序列，如圖5，其條帶在100bp左右。由于NOS終止子采用了雀巢PCR擴增的方法，其特異性很高，因此，可直接判斷此條帶即為NOS終止子的條帶。與CaMV35s啟動(dòng)子一樣，2，3，4泳道中條帶的亮度也依次增強，而泳道 5 是一未知 RR大豆準確含量的樣品。
　　IVR基因是玉米的特異性基因，是判斷所測樣品是否是玉米的特異性基因片段，其長(cháng)度為225bp，如圖6，泳道l，2，3，4為玉米，其長(cháng)度大約在200bp左右；LEC基因是大豆的特異性基因，是判斷所測樣品是否是大豆的特異性基因片段，其長(cháng)度為414bp，在圖6中，泳道5，6，7，8是大豆條帶，大約在400 bp左右。
2.3 限制性?xún)惹忻福?BR>　　由于CaMV35s啟動(dòng)子在進(jìn)行PCR時(shí)會(huì )出現非特異性條帶，因此，需要利用限制性?xún)惹忻高M(jìn)行切割，以確定確實(shí)為CaMV35s啟動(dòng)子。限制性?xún)惹忻竂mnl的切位點(diǎn)是5’-GAANN▲NNTTC-3’，利用Xmnl可以將CaMV35s啟動(dòng)子切割成兩條帶，80bp和115bp。
　　對食品中是否含有轉基因成分進(jìn)行檢測基于以下步驟：（l）食品基因組 DNA 的提取；（2）對插入的CaMV35s啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行PCR擴增；（3）對食品的特異性基因進(jìn)何擴增以確定含有何種成分；（4）利用限制性?xún)惹忻负铜傊悄z電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行確認與描述。
　　上面所描述的方法可以作為檢測RR大豆和Bt-176玉米的一種方法。在這種方法中，DNA的提取很關(guān)鍵，由于玉米的淀粉含量比較高，提取的DNA的效率較低，因此，PCR產(chǎn)物的量不如大豆的多，電泳圖譜的條帶的亮度比大豆的低。我們以后的工作將集中于：（1）對玉米的提取方法進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，并探索其它形式食品的DNA的提取方法；（2）對轉入的目的基因，即靶基因進(jìn)行PCR檢測；（3）對GMO（基因修飾物質(zhì)）進(jìn)行定量。

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