程義勇 洪燕 耿戰輝 李樹(shù)田 王冬蘭 天津衛生學(xué)環(huán)境醫學(xué)研究所，天津 300050
　　隨著(zhù)社會(huì )經(jīng)濟的發(fā)展，人們在工作和生活中所承受的負荷及應激程度日益加大。近年研究資料證實(shí)，現代社會(huì )居民由于心理應激造成的心身危害，是多種退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要誘發(fā)因素。高血壓、糖尿病、冠心病、腫瘤等嚴重危害人類(lèi)健康的疾病，都與心理應激密切相關(guān)〔1〕。如何解決這些問(wèn)題將是現代預防醫學(xué)面臨的重要任務(wù)之一。
　　關(guān)于缺鋅影響心理和行為的問(wèn)題已經(jīng)受到許多人的關(guān)注，但大多數研究報告涉及學(xué)習記憶方面的內容，即認知行為的改變〔2〕；而對于實(shí)驗動(dòng)物或人體缺鋅時(shí)情緒行為方面的變化報道較少。本研究通過(guò)建立大鼠缺鋅及心理應激動(dòng)物模型，運用曠場(chǎng)實(shí)驗觀(guān)察應激引起的實(shí)驗大鼠行為異常；在此基礎上觀(guān)察補鋅對應激損傷的防護作用，并從海馬神經(jīng)細胞鈣、鈣調素以及金屬硫蛋白的基因表達等方面探討有關(guān)的中樞神經(jīng)機制，為合理補充鋅營(yíng)養以提高機體應激適應能力提供科學(xué)依據。

1 材料與方法
1．1 動(dòng)物分組與飼養
　　用本所動(dòng)物中心提供的110±20g雄性Wistar大鼠42只，按體重隨機分為6組：缺鋅組（ZD）、缺鋅應激組（ZD-S），對喂組（PF）、對喂應激組（PF-S），對照組（AL）、對照應激組（AL-S）。其中缺鋅、對照組的飼料Zn含量分別為3.7和41.6mg/kg。PF組喂飼對照飼料，但攝入量與ZD組一致。每天記錄ZD（ZD-S）組攝食量，作為次日PF（PF-S）組的給料量；ZD（ZD-S）組及對照組均自由攝食。所用不銹鋼籠具及玻璃飼料罐均經(jīng) EDTA浸泡24小時(shí)后去離子水浸泡沖洗。實(shí)驗期間，ZD（ZD-S）組給予去離子水。缺鋅喂養時(shí)間為3周。
1．2 缺鋅飼料配制
　　參照Avery等〔3〕的資料略有改動(dòng)，其中的飼料蛋白使用脫鋅處理的大豆蛋白。
1．3 動(dòng)物心理應激模型 實(shí)驗進(jìn)行兩周后，各應激組大鼠接受光-電刺激，光-光周期為50秒，光-電刺　　激間隔為10秒，之后40秒內不定期出現一次光。刺激參數為：⑴ 光：刺激光強度為35-40Lux，持續1秒，燈滅時(shí)實(shí)驗盒內光強度約為2 Lux；⑵ 電：電流強度為1mA，持續1秒。每只大鼠實(shí)驗時(shí)間為30分鐘，連續6天后，各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測定。
1．4 行為測定
　　以曠場(chǎng)實(shí)驗測定實(shí)驗動(dòng)物的行為改變。實(shí)驗時(shí)將大鼠置于曠場(chǎng)中間格，觀(guān)察記錄其自主活動(dòng)情況。
1．5 海馬腦區MT-1 mRNA表達水平檢測（RT-PCR實(shí)驗方法） 海馬組織樣品用異硫氰酸胍一步法提取總mRNA，逆轉錄為cDNA，以?-actin為內標準參照物，導入а-32P- dATP /dCTP，MT-1引物由上海生工生物工程公司合成。
　　PCR擴增條件：94oC預變性, 72 oC延伸，57 oC退火,反復進(jìn)行30周期。
　　產(chǎn)物定量：取PCR擴增產(chǎn)物，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓120V，16h。放射自顯影48h，光密度計掃描，以MT-1/?-actin吸收峰比值表示MT-1相對表達量。
1．6 海馬細胞[Ca2+]i測定
　　參照Dildy的方法制備海馬細胞懸液〔4〕 ，進(jìn)行Fura-2/AM負載，用熒光法測定。
1．7 活性CaM測定
　　參照劉淑紅等〔5〕的方法進(jìn)行。
1．8 統計方法
　　組間進(jìn)行t檢驗, 結果用?X±s 表示。

2．實(shí)驗結果
2．1 實(shí)驗大鼠的曠場(chǎng)行為表現（見(jiàn)表1）
　　表 1． 實(shí)驗大鼠的曠場(chǎng)行為 (?X±s)

中央格 分組 停留時(shí)間（ S ） 穿行格數 直立次數 修飾次數

AL 16.4 ± 7 .7 21.6 ± 10 .3 7 .2 ± 1 .9 6 . 0 ± 4 . 1 AL-S 28.6 ± 16 .4 24 .2 ± 12 .5 5 .6 ± 2 .7 a 0 . 8 ± 1 . 6 b ZD 25.4 ± 11 .3 8 .7 ± 3 .4 a 5 .1 ± 2 .2 a 1 . 0 ± 1 . 3 a ZD-S 31.4 ± 16 .0 a 7 .0 ± 2 .3 a 4 .4 ± 1 .5 a 0 . 9 ± 1 . 4 a PF 30.4 ± 9 .2 b 35 . 7 ± 11 . 3 a 19 .5 ± 6 . 2 b 2 . 7 ± 1 . 2 a PF-S 39.8 ± 20 .4 a 30 .2 ± 16 .2 13 .8 ± 2 .5 b 0 . 1 ± 0 . 3 b

2．2 實(shí)驗大鼠海馬細胞[Ca2+]i及活性CaM水平變化(見(jiàn)表2）
　　表2． [Ca2+]i及活性CaM水平變化情況(?X±s )

Group [Ca 2+ ]i (nmol/L) CaM 熒光強度

AL 172.9 ± 14.5 15.6 ± 1.87 AL-S 257.1 ± 68.0 13.4 ± 1.57 ZD 199.3 ± 12.6 a 11.8 ± 1.52 a ZD-S 283.8 ± 32.1 a 15.0 ± 0.95 PF 180.6 ± 20.5 13.4 ± 1.79 a PF-S 335.1 ± 57.1 a 13.8 ± 1.07 a

2．3 大鼠海馬腦區的MT-1 mRNA表達水平
　　驗結果表明（表3），缺鋅組大鼠海馬腦區MTⅠ的相對表達量明顯低于對喂組和對照組；應激對照組海馬腦區MTⅠ的相對表達量明顯高于對照組，應激對喂組較對喂組也有增高的趨勢，而應激缺鋅組大鼠海馬腦區MTⅠ的相對表達量低于缺鋅組。
　　表3 心理應激對大鼠海馬MT-1 mRNA的影響 (?X±s,n=4)

Group	MT-1/ ? -action
ZD ZD-S PF PF-S AL AL-S	1.173 a b 0.668 2.143 3.255 2.560 4.408 b

3．討論
　　本實(shí)驗采用一種較純粹的心理應激模型，即以燈光和電擊分別作為條件和非條件刺激建立條件反射，再次單獨給予電擊時(shí)，動(dòng)物會(huì )條件反射性地產(chǎn)生緊張和恐懼，此時(shí)軀體刺激成分已經(jīng)很小,主要是心理應激成分的作用。結果發(fā)現：這種心理應激使各組動(dòng)物的水平和垂直運動(dòng)以及修飾次數減少，并且均以缺鋅應激組最為明顯，因此有理由認為缺鋅加重了心理應激對動(dòng)物行為的影響。
　　近期Takeda〔6〕和Itoh 等作者〔7〕發(fā)現，當實(shí)驗大鼠喂飼缺鋅飼料時(shí)其海馬鋅濃度明顯降低，而其他腦區未見(jiàn)顯著(zhù)變化；同時(shí)，海馬突觸體鋅濃度也明顯低于對照，表明海馬是中樞神經(jīng)系統對鋅缺乏敏感的區域。
　　由本研究的測定結果可以看到，缺鋅可引起海馬細胞[Ca2+]i升高而活性CaM水平降低。由于海馬在情緒和行為的調節過(guò)程中起著(zhù)非常重要的作用，這就提示動(dòng)物缺鋅導致的行為異常可能與其引起海馬細胞[Ca2+]i 及其相關(guān)蛋白的變化有關(guān)。關(guān)于神經(jīng)元靜息[Ca2+]i 增加，Franklin等〔8〕曾提出神經(jīng)元生存的Ca2+調定點(diǎn)假說(shuō)（set-points hypothesis）。他認為在機體處于某種“不利”狀態(tài)(如衰老、慢性疾病等)下，[Ca2+]i會(huì )在一定范圍內波動(dòng)(通常是升高)，但當[Ca2+]i大于調定點(diǎn)的高限或小于調定點(diǎn)的低限時(shí)，都會(huì )引起神經(jīng)元功能紊亂甚至死亡。因此我們推測，本實(shí)驗中ZD組海馬細胞[Ca2+]i的升高可能是機體在缺鋅這種不利條件下的生存適應反應；PF組大鼠因長(cháng)期得不到充足食物而處于饑餓這種不利狀態(tài)，可能是其海馬細胞[Ca2+]i增高的原因；而活性CaM水平下降可能正是由于[Ca2+]i升高使CaM向結合型轉化而引起的，也可能是缺鋅時(shí)CaM激活相關(guān)酶使其消耗增加所致。
　　金屬硫蛋白(MTs)是一組富含金屬(如鋅、鎘等)和半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)。有關(guān)的研究表明，MTs在結合和釋放金屬離子，維護鋅銅離子的平衡，保護細胞免于氧化反應，清除重金屬等方面具有重要作用。盡管MT的發(fā)現迄今已有40余年，但有關(guān)腦內MTs的研究起步較晚。近年研究發(fā)現中樞神經(jīng)系統(CNS)中也含有豐富的MTs，哺乳類(lèi)動(dòng)物腦內表達三種MT，即MTⅠ、Ⅱ和Ⅲ。溶液雜交法發(fā)現小鼠腦內三種MT的表達量為MTⅠ>MTⅢ>MTⅡ, MTⅢ和MTⅡmRNA的量分別為MTⅠ的70%和50%。MT是一類(lèi)重要的應激反應蛋白，可通過(guò)清除自由基對抗應激過(guò)程中的抗氧化損傷。本研究發(fā)現缺鋅可抑制海馬腦區MTⅠ的表達，結果減少了心理應激誘導的MTⅠ合成，不利于機體應激適應能力的發(fā)揮。這可能是缺鋅加重心理應激損傷的機制之一。
　　總之，本研究的資料表明了機體缺鋅狀況可能加重心理應激引起的行為異常，這些行為異常與海馬腦區的功能改變密切相關(guān)。海馬神經(jīng)細胞鈣濃度和鈣調素水平的變化，以及海馬腦區MT基因表達的異常，可能是缺鋅導致應激動(dòng)物適應能力下降的重要機制。

4、參考文獻
　　1．程義勇：心理應激研究進(jìn)展。醫藥衛生科學(xué)技術(shù)進(jìn)展， 北京 1996。
　　2．耿占輝：鋅營(yíng)養與腦功能及行為的關(guān)系研究—歷史和現狀。國外醫學(xué) 醫學(xué)地理分冊2001，
22（3）：97
　　3． Avery RA，Bettger WJ． Effects of dietary zinc deficiency and the associated drop
in voluntary food intake on rat erythrocyte membrane polyamines． J Nutr，1988，
118(8)：987-994．
　　4．Dildy JE，Leslie SW． Ethanol inhibit NMDA-induced increase in free intra-
-cellular Ca2+ in dissociated brain cells．Brain Res，1989，499(3)：383-387．
　　5． 劉淑紅，范明，甘思德．細胞內鈣調素相對活性熒光測量方法的改進(jìn)．軍事醫學(xué)科學(xué)院院刊，1996，20(4)：316-317．
　　6. Atsushi Takeda，Sachiyo Takefuta，Shoji Okade，et al． Relationship between brain zinc and transient learning impairment of adult rats fed zinc-deficient diet．Brain Res，2000，859：352-357．
　　7. Itoh T，Saito T． Effect of zinc deficiency on the response of immobilization stress for the adult rat．Trace Elements and Electrolytes，2000，17(2)：76-81．
　　8. Franklin JL,Fickbohm DJ,Willard AL. Long- term regulation of neuronal calcium
currents by prolonged changes of membrane potential.J Neurosci, 1992, 12(5):1726-1735.

 

The Preventive Effects of Zinc on Behavior Changes in Rats under Psychological Stress

Cheng Yiyong, Hong Yan, Geng Zhanhui, Li Shutian, Wang Donglan
Tianjin Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin, 300050

　　The present study is to observe the rat behavior changes induced by psychological Stress, the preventive effects of zinc on the behavioral abnormality as well as the mechanisms involved. The rats were randomly divided into 6 groups: zinc deficiency(ZD), pair-fed(PF), control(AL) and their corresponding groups of stress rats(ZD-S, PF-S, AL-S). The psychological stress model was established by giving the animals light-electric stimulus. The behavior changes were tested in an open field equipment. The experimental results indicated that abnormal behaviors were observed in the rats sustained psychological stress and zinc deficiency made these changes more seriously. It was shown from the present study that the stress-induced behavior abnormality and the preventive effects of zinc on these changes were involved in the levels of calcium and calmodulin of neuron cell in hippocampus, as well as the zinc regulation of metallothionein-1 expression in this brain domain.