孫秀發(fā) 朱清華 劉恭平 楊麗琛 華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院營(yíng)養與食品衛生研究室 武漢 430030
　　維生素A和鋅是兩種極為重要且我國居民膳食相對容易缺乏的微量營(yíng)養素。研究發(fā)現，維生素A嚴重缺乏可導致胚胎一系列畸形（1），其原因與發(fā)育基因表達水平有關(guān)（2）。鋅與體內數百種酶的結構和功能相關(guān)，有報道缺鋅可致胚胎畸形，其機制是缺乏可影響染色質(zhì)的結構和基因表達水平（1）。HOX基因是目前研究最多的胚胎發(fā)育控制基因。為了進(jìn)一步揭示維生素A、鋅的營(yíng)養水平和胚胎發(fā)育的關(guān)系，本文著(zhù)重研究了小鼠的不同維生素A、鋅的營(yíng)養水平與HOX C4（3.5）基因表達的相關(guān)性。

1、材料和方法
1.1動(dòng)物分組及喂養
　　維生素A的研究 清潔級斷乳昆明種小鼠（雌60只，雄30只），由武漢生物制品研究所動(dòng)物中心提供。適應性喂養一周后，將雌鼠按體重隨機分為3組，每組20只：維生素A缺乏組：自始至終以不含維生素A的飼料喂養；維生素A補充組：喂以上述維生素A缺乏飼料，直至受孕第7天開(kāi)始更換含維生素A 10000IU?kg-1的飼料；正常組：始終喂以含維生素A 4000IU?kg-1的正常飼料。飼料配方按AOAC配方修改成。雄鼠飼以普通飼料。動(dòng)物用不銹鋼鼠籠喂養，自由攝食飲水，室溫20℃～25℃，濕度為55％～65%。動(dòng)物在實(shí)驗第16周（維生素A缺乏癥狀明顯時(shí)），按雌∶雄=2∶I合籠交配，清晨查陰栓，陽(yáng)性者為受孕0天。受孕第12天時(shí)，眼眶取血后，脫頸椎處死，取出胎鼠。置液氮中冷凍，再移至－70℃冰箱保存。所用器具必須經(jīng)高溫或用焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理，確保無(wú)RNA酶。
　　鋅的研究 昆明種小鼠（體重25～30g ）由同濟醫科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供，數量、性別、飼養及分組同前。缺鋅組：飼料含鋅量?jì)H為(3.0±0.5）mg?kg-1；補鋅組；飼料中補鋅量達30 mg?kg-1，在受孕第7天才給予補鋅飼料；正常組：自始至終喂以正常飼料。動(dòng)物須用去離子水。籠具、水瓶均用l％Na2EDTA侵泡處理，并定期用去離子水清洗。經(jīng)25天鋅耗竭性喂養后，按上法進(jìn)行交配。受孕第12 天取樣，并取胚胎作相應處理。
　　1.2血清維生素A的測定 采用熒光法（熒光分光光度計為日本日立公司生產(chǎn)的 F－3000型）
　　1.3股骨鋅含量的測定 采用原子吸收分光光度法（北京第二光學(xué)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)，WFX－1F2型)
　　1.4血清堿性磷酸酶（AKP）活性測定 采用北京中生生物工程技術(shù)公司生產(chǎn)的AKP試劑盒測定
　　1.5胎鼠 HOX 3.5基因mRNA的測定（原位雜交法）
　　胚胎組織總RNA的提取：隨機取正常組受孕12 d胎鼠若干，利用TRIzol Total RNA提取試劑盒（美國GIBCO公司產(chǎn)品）提取總RNA。
　　探針的制備：根據從Internet網(wǎng)上基因庫檢索的HOXC4（3.5）基因的DNA序列，在H 3.5第一外顯子區設計一對引物，長(cháng)度為21個(gè)堿基，由GIBCO BRL公司合成。利用TitanTM 0ne Tube RT-PCR System（德國 Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品）和上述合成的引物進(jìn)行PCR擴增，獲得cDNA片段作為DNA探針，長(cháng)度為247bp。 按照地高辛DNA標記及檢測試劑盒（Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品）的方法，標記探針。
　　病理切片的制作：將鼠胎從－70℃取出后置于－20℃，在恒冷切片機上將鼠胎沿旁矢狀切面切成6～8μm厚的切片（每只鼠胎切兩張切片），迅速置于4％的多聚甲醛室溫固定20min。PBS洗后，逐級酒精脫水。然后，－20℃保存備用。
　　原位雜交：用地高辛標記的探針與鼠胎切片進(jìn)行原位雜交，探查HOXC4（3.5）的mRNA，并用酶聯(lián)免疫顯色（采用地高辛DNA標記及檢測試劑盒）。具體操作步驟詳見(jiàn)文獻（3）。操作過(guò)程中，顯色時(shí)間、條件保持一致，避免操作誤差。
　　雜交結果的定量分析：采用HPLAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統，對雜交點(diǎn)的陽(yáng)性表達面積千分比（即面積密度（Area Density）=一個(gè)視野中陽(yáng)性表達面積之和／一個(gè)視窗面積），及其平均光密度（L-Density）進(jìn)行測定。該系統在測定過(guò)程中，可自動(dòng)扣除背景干擾。
　　1.6統計處理 實(shí)驗結果用平均數±標準差（?X±s）表示。組間用SAS統計分析軟件進(jìn)行方差分析。

2、結 果
2.1血清維生素A與HOX C4 (3.5）基因表達的相關(guān)性
　　動(dòng)物經(jīng)長(cháng)達16周的無(wú)維生素A的飼料喂養，缺乏組和補充組雌鼠均出現皮毛干枯、胡須脫落、反應淡漠、眼部有膿性分泌物，食量減少和不喜活動(dòng)等缺乏癥狀。實(shí)驗結束以后，其血清維生素A水平和HOX基因表達的mRNA水平見(jiàn)表1。
　　表1 孕鼠血清Vit.A及小鼠胚胎中HOX3.5基因的表達 （?X±s）

組別	n	血清 Vit.A( μ mol · L -1 )	面積密度	積分光密度
缺乏組	8	0.44 ± 0.06 a	0.05 ± 0.01 a	433.9 ± 122.0 a
補充組	8	1.03 ± 0.12 ab	0.07 ± 0.01 ab	685.2 ± 206.4 ab
正常組	8	1.40 ± 0.32	0.10 ± 0.05	932.4 ± 180.4

　　 由表1可知，受食物因素影響，維生素A缺乏組、補充組和正常組間血清維生素A水平逐步升高，并有顯著(zhù)差異（P<0.05）；其面積密度和積分光密度兩個(gè)指標也呈相同規律。血清維生素A水平和面積密度、積分光密度呈正相關(guān)，相關(guān)系數見(jiàn)表4。
　　2.2鋅的營(yíng)養水平和HOX基因表達相關(guān)性
　　動(dòng)物經(jīng)5周的缺鋅飼料喂養，出現了脫毛、脫須、眼分泌物增高等缺鋅癥狀。相關(guān)指標檢測結果見(jiàn)表2、表3。鋅營(yíng)養水平和基因表達水平各項指標按缺鋅組、補鋅組、正常組依次逐步升高，其它倆組與正常組比較均有顯著(zhù)差異（P<0.05）。血清AKP與面積密度、積分光密度呈高度正相關(guān)；股骨鋅含量與面積密度、積分光密度也呈高度正相關(guān)。相關(guān)系數見(jiàn)表4。
　　表2 孕鼠血清AKP活性和股骨鋅濃度 （?X±s）

組別	n	堿性磷酸酶（ AKP ， U · L -1 ）	Zn(mg · kg -1 )
缺乏組	4	6.04 ± 1.82 a	124.3 ± 11.2 a
補充組	4	17.41 ± 2.97 b	152.1 ± 19.5 a
正常組	4	21.07 ± 6.34	193.8 ± 20.7

　　表3 不同鋅營(yíng)養水平母鼠的胎鼠HOX C4 (3.5）基因表達結果 （?X±s）

組別	n	面積密度	積分光密度
缺乏組	16	0.07 ± 0.01 a	0.07 ± 0.01 a
補充組	16	0.09 ± 0.01 ab	0.09 ± 0.01 ab
正常組	16	0.16 ± 0.02	0.11 ± 0.01

　　表4 母鼠Vit.A、Zn營(yíng)養水平與HOX C4 (3.5）基因表達相關(guān)關(guān)系（r）

HOX 基因表達
營(yíng)養指標	面積密度	積分光密度
血清 AKP	0.78	0.90
股骨 Zn	0.96	0.99
血清 Vit.A	0.98	0.99

3、討 論

　　同源異形盒基因（Homeobox gene）自1984年首次發(fā)現以來(lái)，已有了大量的研究報道。至今在鼠類(lèi)和人類(lèi)共發(fā)現了4簇同源異形盒序列，分別是HOX-A、HOX-B、HOX-C、HOX-D（4）。這些基因表達沒(méi)有組織特異性，而只在胚胎發(fā)育過(guò)程中有各自不同的時(shí)間和空間特異性（5）。雖然對這類(lèi)基因的結構、表達和調控的功能、機制有不少相關(guān)報道，但仍未到弄清的程度。在小鼠受孕第7天以后，胚胎正處于器官發(fā)生期，我們在研究中發(fā)現，此時(shí)母鼠維生素A和鋅缺乏不僅可導致胎鼠畸變發(fā)生，而且也影響了HOX C4（3.5）的表達（6）。所以母乳體內的維生素A和鋅的營(yíng)養水平對相應的基因表達及胎兒的正常發(fā)育十分重要。
　　低水平的血清維生素A可以確定為維生素A缺乏（7），尤其是對于長(cháng)期攝入不含維生素A飼料的動(dòng)物更是可靠。缺鋅可使血清AKP活性明顯下降，股骨鋅可反映鋅的膳食水平（8），將兩個(gè)指標綜合考慮可反映機體鋅的營(yíng)養水平。
　　本研究發(fā)現機體維生素A和鋅的營(yíng)養水平處于正常、缺乏改善和缺乏三個(gè)不同水平的母鼠與其胚胎HOX C4（3.5）的表達水平呈高度正相關(guān)，其相關(guān)系數自0.78至0.99。在6個(gè)相關(guān)分析中，有五個(gè)相關(guān)系數是在0.96以上。這一結果充分證明了維生素A的不同營(yíng)養水平和鋅缺乏可以影響小鼠胎兒發(fā)育的機制之一是影響了HOX C4（3.5）基因的表達，而且兩者呈高度正相關(guān)關(guān)系。這種影響的分子調控機制仍有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻
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　　6 樊建設，朱清華，劉烈剛. 維生素A缺乏對小鼠胚胎HOX基因表達的影響。營(yíng)養學(xué)報，1999，21（4）：384-387
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