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達能營(yíng)養中心第七屆學(xué)術(shù)研討會(huì )論文集
先天性心臟病核心家庭蛋氨酸合酶基因多態(tài)性研究
（北京大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系，北京 100083；*中國醫科大學(xué)附屬第二醫院，沈陽(yáng) 110001）
摘要： 目的：初步探討蛋氨酸合酶（MS）基因變異與先天性心臟病（CHD）表型的關(guān)系。方法：通過(guò)出生缺陷登記卡選擇遼寧省193名CHD患者（其中男94人，女99人）及其生物學(xué)父母（核心家庭）作為病例組，另選取同地區且無(wú)出生缺陷病史及家族史的104名正常人（男60人，女44人）及其生物學(xué)父母作為對照組，進(jìn)行MS基因A2756G位點(diǎn)多態(tài)性檢測（PCR-RFLP法）。結果：正常人群（對照組子代）中存在MS基因A2756G位點(diǎn)雜合突變(+/-),但未檢出純合突變(+/+)基因型，其中(+/-)基因型和(+)等位基因的頻率分別為10.7％和5.3％。CHD患者及其母親的基因型構成和等位基因頻率與對照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），病例組父親(+)等位基因頻率（5.0％）低于對照組（9.1％，P＝0.060），其子代罹患CHD的比值比（OR）為0.53(95％可信區間：0.25～1.09)。兩組父母基因型組合差異無(wú)顯著(zhù)性。不同類(lèi)型CHD組與對照組核心家庭成員A2756G位點(diǎn)基因型構成比亦無(wú)明顯差異；等位基因傳遞失衡分析顯示，突變等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遺傳失衡現象，即父母將等位基因(+)傳給CHD患者的比例低于(-)，其OR值為0.26(95％可信區間：0.11～0.60)。結論：個(gè)體MS基因A2756G位點(diǎn)變異與CHD發(fā)生無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究；而親代MS基因A2756G位點(diǎn)變異與子代CHD的發(fā)生相關(guān)，其突變等位基因(+)可能降低子代CHD的危險性。
關(guān)鍵詞： 蛋氨酸合酶 基因多態(tài)性 先天性心臟病 核心家庭
先天性心臟病（Congenital heart disease，CHD）是指胚胎或胎兒在宮內發(fā)生的心臟發(fā)育異常，是兒科最常見(jiàn)的病種之一，亦是導致孕婦流產(chǎn)、圍產(chǎn)兒和嬰幼兒死亡的最主要原因之一。目前有關(guān)CHD的病因學(xué)及發(fā)病機理尚不完全清楚，但絕大多數CHD為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果，屬多基因病。近年來(lái)有關(guān)Hcy與出生缺陷的關(guān)系受到研究人員的日益關(guān)注。大量基礎研究以及流行病學(xué)調查結果顯示高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥是出生缺陷，尤其神經(jīng)管畸形發(fā)生的一項重要的危險因素，而神經(jīng)管與心臟的發(fā)育存在一定關(guān)聯(lián)；動(dòng)物實(shí)驗結果顯示Hcy可致雞胚心血管發(fā)育畸形【1,3】；遺傳流行病學(xué)研究也表明Hcy代謝關(guān)鍵酶——亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變是嬰兒發(fā)生CHD的危險因素【4】。以上結果提示高Hcy血癥可能與CHD的發(fā)生有關(guān)【2】。Hcy是必需含硫氨基酸——蛋氨酸在機體幾乎所有組織中的代謝中間產(chǎn)物，它的主要代謝途徑之一是再甲基化為蛋氨酸，該過(guò)程由蛋氨酸合酶（MS）催化完成。MS基因缺陷可能導致其酶活性的改變，使Hcy再甲基化途徑受阻進(jìn)而引起Hcy蓄積，并與CHD的發(fā)生相關(guān)。但目前尚未見(jiàn)關(guān)于MS基因變異與CHD關(guān)系的報道。
核心家庭是指由一個(gè)子女及其生物學(xué)父母所組成，以子代的兩個(gè)等位基因為“病例”，以父母的非遺傳等位基因為“內對照”，尋找與疾病發(fā)病有關(guān)的遺傳標志。其優(yōu)點(diǎn)為不必為病例尋找具有相同背景的對照而可以克服遺傳因素的種族差異的混雜作用。本研究一方面通過(guò)成組匹配的病例－對照設計探討親代及子代MS基因型與子代CHD表型的關(guān)系；另一方面通過(guò)核心家庭內的病例－父母對照研究了解MS等位基因的傳遞失衡情況。
1 對象與方法
1.1 研究對象
通過(guò)出生缺陷登記卡選擇遼寧省193名CHD患者（0～31歲，其中男94人，女99人）及其生物學(xué)父母作為病例組。CHD類(lèi)型由專(zhuān)科醫生確診，包括85例（44.0％）單純室間隔缺損患者、28例（14.5％）動(dòng)脈導管未閉、19例（9.8%）法樂(lè )四聯(lián)征、16例（8.3％）房間隔缺損、32例（16.6％）其它類(lèi)型（如肺動(dòng)脈狹窄、右室雙出口、三尖瓣下移、主動(dòng)脈縮窄等）及13例（6.7%）多種CHD合并的患者。
另選取同地區且年齡、性別匹配，無(wú)出生缺陷病史及家族史的104名正常人（0～33歲，其中男60人，女44人）及其生物學(xué)父母作為對照組。
1.2 研究方法
1.2.1 血樣采集 采集核心家庭成員空腹靜脈血3～5毫升，分離血清與血凝塊。
1.2.2 MS基因A2756G位點(diǎn)多態(tài)性檢測
鹽析法由血凝塊中提取基因組DNA。
聚合酶鏈反應（PCR）擴增特異片斷，引物參照文獻設計【6】，序列為上游引物5＇-CAT GGA AGA ATA TGA AGA TAT TAG AC-3＇和下游引物5＇-GAA CTA GAA GAC AGA AAT TCT CTA-3＇。PCR反應體系10μl，其中各成分的終濃度分別為氯化鎂2.0 mmol·L1、引物0.5μmol·L1、三磷酸脫氧核糖核苷酸0.25 m mol·L1，Taq DNA聚合酶1.2單位，DNA模板2μl。PCR反應條件為94℃4分鐘（預變性），94℃30秒（變性）、55℃30秒（退火）和72℃45秒（延伸）共30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃7分鐘。
PCR擴增產(chǎn)物用6單位HaeⅢ限制性?xún)惹忻?7℃消化4小時(shí)后，以12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析酶切片段，僅有189bp一個(gè)片段為野生型（-/-），有三個(gè)片段189bp、159bp、30bp為雜合突變型（+/-），有159bp、30bp兩個(gè)片段者為純合突變型（+/+）。
1.2.3 資料整理與分析
采用SPSS和Epi Info統計軟件進(jìn)行數據分析：⑴ 通過(guò)χ2檢驗比較CHD 組與對照組核心家庭MS基因型構成比；⑵ 以CHD患者的兩個(gè)等位基因作為“病例” ,以父母未傳給胎兒的兩個(gè)等位基因作為“對照”，進(jìn)行1：1配對的病例對照研究，計算傳遞失衡指數（Transmitted Disequillibrium Test，TDT）；按成組資料整理數據，計算基于單體型的單體型相對危險度（Haplotype-based Haplotype Relative Risk，HHRR）。
2 結果
2.1 病例組與對照組MS基因A2756G位點(diǎn)基因型構成及等位基因頻率比較
本研究正常人群（對照組子代）中存在MS基因A2756G位點(diǎn)雜合突變(+/-),但未檢出純合突變(+/+)基因型；其中(+/-)基因型和(+)等位基因的頻率分別為10.7％和5.3％，且無(wú)性別差異（χ2＝1.255，P>0.05）。
不同組別分析顯示（如表1），病例組與對照組子代基因型構成及等位基因頻率無(wú)明顯差異（P>0.05），分性別分析亦如此。與(-/-)基因型相比，(+/-)基因型罹患CHD的比值比（Odds ratio，OR）為0.84(95％可信區間，0.35～2.01)。
如表2所示，病例組與對照組母親的基因型分布和等位基因頻率無(wú)明顯差異（P>0.05）。其中病例組父親(+)等位基因攜帶者(+/-和+/+基因型)的構成比（10.0％）低于對照組（17.2％，P＝0.084），OR值為0.54(95％可信區間，0.25～1.16)；(+)等位基因頻率（5.0％）亦低于對照組（9.1％，P＝0.060），OR值為0.53(0.25～1.09)。
Table 1. Comparison of Genotype Distribution in CHD Patients with Control at MS A2756G Locus
Note. a Compared of genotype frequency with control group by chi-square test, b Compared with control group [OR ＝ 0.85(0.37-1.98) , P = 0.680].
Table 2 Comparison of Genotype Distribution and Allele Frequencies in CHD Parents with Control at MS A2756G Locus
Note. a Compared of genotype frequency with control group by chi-square test, b Compared with control group by chi-square test, Mother: OR ＝ 1.10(0.52-2.40), P ＝ 0.785, Father: OR ＝ 0.53 (0.25-1.09), P ＝ 0.060, Total: OR ＝ 0.76(0.45-1.26) , P ＝ 0.255.
2.2不同類(lèi)型CHD組A2756G位點(diǎn)基因型構成比較
將伴或不伴其它類(lèi)型CHD的一類(lèi)患者作為一組（如室間隔缺損組包括單純室間隔缺損及室缺合并有其它類(lèi)型CHD的病例），比較不同類(lèi)型CHD患者A2756G位點(diǎn)基因型構成，結果顯示各組間無(wú)明顯差異（如表3）。
不同類(lèi)型CHD組與對照組親代A2756G位點(diǎn)基因型構成比亦無(wú)明顯差異（如表4）。
Table 3. Comparison of Genotype Distribution among Different Types of CHD Patients with Control Group at MS A2756G Locus
|
Group |
n |
Genotype n(%) |
OR(95％CI) |
P-value a | |
|
-/- |
+/- | ||||
|
Ventricular septal defect |
91 |
80( 87.9) |
11(12.1) |
1.15(0.44-3.04) |
0.758 |
|
Atrial septal defect |
21 |
19( 90.5) |
2( 9.5) |
0.88(0.00-4.78) |
0.875 |
|
Patent ductus arteriosus |
34 |
32( 94.1) |
2( 5.9) |
0.52(0.08-2.60) |
0.327 |
|
Tetralogy of Fallot |
20 |
20(100.0) |
0( 0.0) |
0.00(0.00-2.02) |
0.126 |
|
Other types |
9 |
9(100.0) |
0( 0.0) |
0.00(0.00-4.94) |
0.302 |
|
Control |
103 |
92( 89.3) |
11(10.7) |
|
|
Note. a Compared with control group by chi-square test.
Table 4. Comparison of Genotype Distribution in Parents among Different Types of CHD with Control at MS-A2756G Locus
|
Group |
Parent |
n |
Genotype n(%) |
OR (95％CI) |
P-value a | |
|
-/- |
+/- and +/+ | |||||
|
Ventricular septal defect |
Mother |
90 |
79(87.8) |
11(12.2) |
1.03(0.40,2.68) |
0.943 |
|
Father |
86 |
77(89.5) |
9(10.5) |
0.56(0.22,1.44) |
0.192 | |
|
Atrial septal defect |
Mother |
19 |
18(94.7) |
1( 5.3) |
0.41(0.01,3.15) |
0.396 |
|
Father |
21 |
19(90.5) |
2( 9.5) |
0.51(0.05,2.46) |
0.521 | |
|
Patent ductus arteriosus |
Mother |
32 |
29(90.6) |
3( 9.4) |
0.77(0.13,3.13) |
0.697 |
|
Father |
36 |
31(86.1) |
5(13.9) |
0.78(0.21,2.45) |
0.649 | |
|
Tetralogy of Fallot |
Mother |
20 |
17(85.0) |
3(15.0) |
1.31(0.21,5.60) |
0.713 |
|
Father |
19 |
18(94.7) |
1( 5.3) |
0.27(0.01,1.96) |
0.299 | |
|
Control |
Mother |
101 |
89(88.1) |
12(11.9) |
|
|
|
Father |
99 |
82(82.8) |
17(17.2) |
|
| |
Note. a Compared with control group by chi-square test.
2.3 病例組與對照組父母基因型組合比較
如表5所示，病例組與對照組父母基因型組合差異無(wú)顯著(zhù)性。進(jìn)一步比較父母至少一方攜帶(+)等位基因與雙方均為野生型組合（-/-和-/-）的家庭數，結果顯示亦無(wú)明顯差異（χ2＝1.060，P＝0.303），OR值為0.74(0.40～1.37)。
Table 5. Comparison of Genotype Combination of CHD Parents with Control
Note. a Compared between two groups by chi-square (P ＝ 0.121).
2.4 CHD核心家庭內等位基因的傳遞失衡分析
以CHD患者的一對等位基因為病例，以父母未遺傳給CHD患者的一對等位基因為對照，進(jìn)行1:1配對的病例對照研究，計算TDT（表6）；此外按成組匹配的病例對照研究方法整理資料，計算HHRR(表7)。結果顯示突變等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遺傳失衡現象，即由于父母將較大比例的等位基因(-)傳給胎兒 ,使胎兒罹患CHD的可能性增高,而(+)等位基因使胎兒發(fā)生CHD的可能性降低。
Table 6. Analysis of TDT in CHD Nuclear Families
Note. a TDT(χ2) ＝ 10.028, P < 0.05, OR ＝ 0.29.
|
Group |
n |
Genotype combination of parents a n(％) | ||
|
-/- and -/- |
-/- and (+/- or +/+) |
+/- and (+/- or +/+) | ||
|
Case |
172 |
135(78.5) |
33(19.2) |
4(2.3) |
|
Control |
96 |
70(72.9) |
26(27.1) |
0(0.0) |
Table 7. Analysis of HHRR in CHD Nuclear Families
|
Allele without transmission from parents |
Allele number of CHD patients a |
Total | |
|
+ |
- | ||
|
+ |
1 |
28 |
29 |
|
- |
7 |
280 |
287 |
|
Total |
8 |
308 |
316 |
Note. a HHRR(χ2) ＝ 12.66, P = 0.000, OR ＝ 0.26(95%CI:0.11-0.60).
3 討論
MS的主要生化功能是催化Hcy再甲基化為蛋氨酸，是Hcy代謝途徑的關(guān)鍵酶。MS基因定位于染色體1q43，已知的人類(lèi)MS基因突變有十余種，其中第2756位堿基A→G（A2756G，相當于密碼子919D→G）在西方人群中較為常見(jiàn)，并可能導致血清Hcy水平的改變。本研究正常對照人群中雜合突變基因型(+/-)構成比為10.7％，未檢出純合突變(+/+)基因型；(+)等位基因的頻率為4.6％。據報道白種人中A2756G位點(diǎn)雜合子檢出率為30％，純合子為4％左右【10】；日本人(+)等位基因頻率為17％【11】；中國正常人群雜合子為17％，純合子1％，(+)等位基因頻率為9.5％【6】。由于遺傳變異存在種族差異和地區差異，該結果提示本研究人群A2756G位點(diǎn)變異頻率明顯低于白種人和日本人，甚至低于其它研究報道的中國人群頻率。考慮到遺傳變異差異性的客觀(guān)存在以及樣本的代表性，有關(guān)中國人群MS基因A2756G位點(diǎn)多態(tài)性問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。
本研究進(jìn)一步分析了MS基因A2756G位點(diǎn)變異與CHD的關(guān)系，結果顯示CHD患者與對照組的基因型構成及等位基因頻率無(wú)明顯差異（P>0.05），雜合突變子(+/-)的OR值為0.84(95％可信區間：0.35～2.01)。分性別分析及不同類(lèi)型CHD患者與對照組基因型構成差異亦無(wú)顯著(zhù)性（P>0.05），OR值介于0～1.15之間。由于親代基因變異一方面可能通過(guò)將突變基因遺傳給子代造成子代表型改變，另一方面也可能引起宮內高危環(huán)境從而影響子代胎兒期的發(fā)育。因此了解親代基因型與子代表型之間的關(guān)聯(lián)，對于出生缺陷的早期篩查和防治具有重要的意義。本研究分析了先心病患者親代MS基因變異情況，結果顯示病例組與對照組母親的基因型分布及等位基因頻率無(wú)明顯差異，而病例組父親(+)等位基因頻率（5.0％）低于對照組（9.1％，P＝0.060），其子代罹患CHD的OR值為0.53(0.25～1.09)。該結果提示親代（尤其父親）攜帶突變等位基因(+)可能使子代發(fā)生CHD的危險性降低。
有關(guān)MS基因多態(tài)性與CHD發(fā)生的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報道，已有研究多集中于MS基因變異與神經(jīng)管畸形的關(guān)聯(lián)【12】，但研究結果并不一致，尚不能完全證明MS基因突變是否與神經(jīng)管畸形有關(guān)【13】。前已述及，MS是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，而MS基因2756A→G變異可導致919位密碼子D→G的缺失突變，使編碼的天冬氨酸置換為甘氨酸。由于該密碼子編碼的氨基酸位于酶活性區域，因此推測該位點(diǎn)突變可能通過(guò)改變蛋白質(zhì)的二級結構，使MS活性上升或減弱，從而影響體內Hcy水平，以及進(jìn)一步干擾胚胎期心血管和神經(jīng)等多個(gè)器官、系統的發(fā)育【10】。有研究表明Hcy水平在(-/-)、(+/-)及(+/+)基因型間呈遞減趨勢【10,5】，也有研究表明A2756G位點(diǎn)變異與Hcy水平無(wú)明顯相關(guān)或變異導致Hcy升高【8,9】。本研究結果顯示親代攜帶突變等位基因(+)可降低子代CHD危險性，這提示MS基因變異可能使酶活性增加，進(jìn)一步導致Hcy水平下降，以及與之相關(guān)的出生缺陷危險性降低。因此本研究下一步將進(jìn)行Hcy水平的測定，以驗證A2756G位點(diǎn)突變與Hcy的關(guān)系，為進(jìn)一步明確MS基因變異與CHD的關(guān)聯(lián)架設橋梁。
以父母為對照的病例對照研究本質(zhì)上是一種配對研究，這種方法的實(shí)質(zhì)是以患兒的兩個(gè)等位基因作為“病例”，以父母未傳給胎兒的兩個(gè)等位基因作為“對照”，最大的優(yōu)點(diǎn)是不必為病例尋找具有相同遺傳背景的對照而可以克服遺傳因素的種族差異的混雜作用【7】。本研究結果顯示突變等位基因(+)在CHD核心家庭中存在遺傳失衡現象，即父母傳給胎兒等位基因(-)的比例大于(+)，因此等位基因(-)使胎兒罹患CHD的可能性增高，而突變等位基因(+)則使胎兒發(fā)生CHD的危險性降低，其OR值為0.26(95％可信區間：0.11～0.60)。這與前述結果一致。因此本研究可初步認為親代MS基因A2756G位點(diǎn)變異與子代CHD的發(fā)生相關(guān)，其突變等位基因(+)可能降低子代CHD的危險性。
致謝:本研究由國家重點(diǎn)基礎研究發(fā)展規劃“973”項目（G1999055904）和法國達能膳食營(yíng)養與宣教基金（DIC2002－08）資助。
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ZHU Wen-li，CHEN Jun，DAO Jing-jing，et al.
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China
Objective To investigate the relations of methionine synthase (MS) gene variation with congenital heart disease (CHD) phenotype. Methods 193 CHD patients (94 male and 99 female) and their biological parents (nuclear families) in Liaoning province were selected as case group, and another 104 normal population (60 male and 44 female) and their parents without family history of birth defects as control group. For all subjects the polymorphism of MS gene A2756G locus was examined by PCR-RFLP method. Results In offspring of control group the frequencies of MS genotype (+/-) and allele (+) were 10.7% and 5.3%, without existence of homozygote. The MS genotype distribution and allele frequencies of CHD patients and their mothers were not significantly different with control (P > 0.05). The frequency of allele (+) in case fathers (5.0 %) was apparently lower than control (9.1%, P = 0.060), and the odds ratio (OR) was 0.53 (95% CI: 0.25-1.09). There was no difference in parents’ genotype combination between two groups and either no difference in genotype distribution among different types of CHD. The analysis of genetic transmission indicated that the mutation allele (+) existed transmission disequilibrium in CHD nuclear families. The percentage of allele (+) transmitted from parents was lower than allele (-) with OR 0.26 (95% CI: 0.11-0.60). Conclusion The study showed that the MS gene variation in parents was associated with occurrence of CHD in offspring, and the mutation allele (+) in parents might be related with the decrease of CHD risk in offspring.
Key words: Methionine synthase; Gene polymorphism; Congenital heart disease; Nuclear family