韓軍花，楊月欣，門(mén)建華，邊立華，楊曉光, 朱元招¹

（中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京，100050；¹農業(yè)部飼料工業(yè)中心，北京，100094）

 

摘要： 目的：研究和比較表達豇豆胰蛋白酶抑制劑基因大米（轉SCK基因大米）和親本大米中蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率的差異，從而探討其生物利用率的異同。  方法：本研究選用豬為實(shí)驗動(dòng)物，通過(guò)外科手術(shù)法在其回腸末端放置T型瘺管，并分別喂飼轉SCK基因大米和親本大米，收集動(dòng)物回腸末端消化產(chǎn)物，從而分析和計算兩種大米蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率。結果：轉SCK基因大米與親本大米中蛋白質(zhì)的表觀(guān)消化率和真消化率相似；氨基酸消化率的測定結果顯示，除親本大米中賴(lài)氨酸的表觀(guān)消化率與SCK基因大米相比有差異外，其余氨基酸的表觀(guān)消化率和真消化率之間均無(wú)顯著(zhù)性差異。結論：外源性基因的插入未改變大米中蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率，在蛋白質(zhì)和氨基酸消化率方法基本滿(mǎn)足“實(shí)質(zhì)等同性”的要求。

關(guān)鍵詞： 轉基因大米  表觀(guān)消化率  真消化率

 

 

轉基因食品在全球迅猛發(fā)展，其食用安全性是每個(gè)人首先考慮的問(wèn)題。此外，轉基因食品營(yíng)養學(xué)方面還有許多令人擔心之處。各種營(yíng)養成分含量的變化、是否會(huì )出現新的抗營(yíng)養因子和天然毒素、重要營(yíng)養素的生物利用率是否發(fā)生改變等都是需要研究解決的問(wèn)題。

水稻是我國居民的主要糧食作物，占我國糧食總產(chǎn)量的40%。提高水稻產(chǎn)量、防止病蟲(chóng)害一直是世界范圍內農業(yè)技術(shù)上的重要任務(wù)。我國科學(xué)工作者經(jīng)過(guò)多年的研究，培育出了表達豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的大米（轉SCK基因大米），經(jīng)田間實(shí)驗證明，對絕大部分水稻害蟲(chóng)有較強的抑制作用。

本研究選取轉SCK基因大米，利用實(shí)質(zhì)等同性原則和個(gè)案分析原則對其進(jìn)行營(yíng)養學(xué)評價(jià)。由于該轉基因大米轉入了由豇豆中提取出的胰蛋白酶抑制劑基因，該外源基因在食物中表達的蛋白本身是否容易被機體降解、其表達的胰蛋白酶抑制劑是否是會(huì )影響到大米中蛋白質(zhì)或氨基酸在小腸內的消化吸收情況，這些都是評價(jià)其營(yíng)養學(xué)價(jià)值時(shí)首先應該考慮的問(wèn)題。

本研究利用實(shí)驗豬回腸末端T型插管技術(shù)，收集動(dòng)物回腸末端的消化產(chǎn)物，對轉SCK基因大米和親本大米中蛋白質(zhì)和氨基酸等重要營(yíng)養素的生物利用率進(jìn)行比較，以期為轉SCK基因大米全面的營(yíng)養學(xué)評價(jià)提供系統數據，并為建立轉基因食品營(yíng)養學(xué)評價(jià)體系提供參考。

 

 

轉基因水稻與親本水稻來(lái)自中國科學(xué)院遺傳所福建基地，該基地地處東經(jīng)116’40、北緯26’06，海拔130米，土壤為沙壤土。受試大米于2002年6月20日播種，7月14~17日插秧，采用濕潤育秧，秧齡26~29天。8月8日烤田，8月25日復水，9月16~18日抽穗，10月23~27日收獲。水稻收獲后儲存于陰涼干燥處，通風(fēng)良好。實(shí)驗前在北京房山糧食加工廠(chǎng)經(jīng)相同的脫殼處理（不進(jìn)行刨光加工），保持其谷粒的完整性，抽真空保存，備實(shí)驗用。

從北京市昌平縣流村豬廠(chǎng)挑選健康去勢公豬（杜洛克×長(cháng)白×大白） 10頭，術(shù)前單個(gè)放入代謝籠內，適應喂養7天，期間行腸道驅蟲(chóng)處理。禁食36小時(shí)，禁水12小時(shí)后，行腹腔外科手術(shù)。動(dòng)物的手術(shù)和食糜的收集實(shí)驗均在農業(yè)部飼料工業(yè)中心代謝實(shí)驗室進(jìn)行。

按照霍啟光等^[1]的方法進(jìn)行手術(shù)。術(shù)前用1mg/kg體重的鹽酸氯氨酮對實(shí)驗用豬進(jìn)行全身麻醉后，左側臥位保定于手術(shù)臺上。常規外科手術(shù)方法消毒后，在腹中線(xiàn)上方20cm，下肋骨約10cm處，縱向做長(cháng)約6cm的切口，分離內外腹斜肌，剪開(kāi)腹膜，順腸管向后找到回盲部。在距回盲瓣10cm處的回腸上作一長(cháng)約4cm的切口，將瘺管凹端放入，繞瘺管行小腸荷包縫合。然后將瘺管送回腹腔，在距原切口頭側5cm處另做一切口，引出瘺管，并用螺母固定，注意勿使腸管扭轉。逐層將腹膜、肌肉及皮膚縫合，用酒精和碘酒消毒手術(shù)部位。

在適應期和手術(shù)恢復期內豬飼料的營(yíng)養水平達到或超過(guò)NRC（1998）的營(yíng)養水平。動(dòng)物術(shù)后的恢復期為15天。詳細記錄代謝室內的溫濕度和每頭豬的攝食情況。前7天每日給豬注射青霉素80萬(wàn)單位，每日兩次。手術(shù)部位用碘酒和酒精擦拭，保持清潔以避免感染。術(shù)后7天拆線(xiàn)，并用氧化鋅-凡士林軟膏對創(chuàng )口部位進(jìn)行護理。

將脫殼后的大米樣品磨碎，并過(guò)20目篩。添加1%的大豆色拉油以增加適口性和避免飼料粉塵。按0.1%的比例加入指示劑三氧化二鉻。

挑選術(shù)后恢復良好、進(jìn)食正常的實(shí)驗豬6頭，實(shí)驗前期先測定每頭動(dòng)物的內源性氨基酸排出量，即給動(dòng)物喂飼含5%酪蛋白的飼料，適應期5天，觀(guān)察并記錄每頭實(shí)驗用豬的進(jìn)食量，6~7天收集食糜，以測定和計算內源性氮或氨基酸的排出量。隨后將動(dòng)物分成兩組，其中4只動(dòng)物給予轉基因大米飼料，另2只給予對照大米飼料，同樣適應5天后連續收集兩天的食糜。第一期實(shí)驗結束后，每頭動(dòng)物均更換為另一種飼料，即4只給予對照大米飼料而另外2只給予轉基因大米飼料，重復以上實(shí)驗步驟。每天飼料量為動(dòng)物體重的3%~4%，料水比為1：2.5，每天早8：00和晚18：00各喂飼一次。

    從早8：00到晚18：00連續收集食糜10個(gè)小時(shí)，食糜排出后通過(guò)醫用肛門(mén)圈收集到封口塑料袋內（可避免收集食糜過(guò)程中牽動(dòng)瘺管，有利于實(shí)驗豬的健康和防止瘺管脫落）。根據每只動(dòng)物食糜的排出情況每1~2小時(shí)收集一次，并馬上置于-20℃的冰柜中保存備檢。

實(shí)驗結束后，將每頭豬每期的食糜樣品解凍后混合均勻，各取部分樣品進(jìn)行冷凍干燥。并在室溫下回潮成風(fēng)干樣品，再經(jīng)粉碎處理制成40目粒度的分析樣品，裝入封口塑料袋中低溫保存備測。

大米、飼料、食糜中氮含量的測定：微量凱氏定氮法^[2]；

飼料、食糜中18種氨基酸含量的分析采用三種水解法進(jìn)行，色氨酸以4.2mol NaOH水解；胱氨酸以過(guò)甲酸氧化法處理；其余16種氨基酸以6mol HCl水解；自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測定^[3]；

飼料和食糜中鉻含量采用濕消化法^[4]，（硝酸：高氯酸為4：1），用原子吸收分光光度計（VARIAN  AA200）測定。

植酸含量的測定采用國標法 GB/T 17406-1998“食品中植酸的測定”。

氮和氨基酸回腸末端表觀(guān)消化率的計算公式為^[5]：

                  飼料中Cr含量      食糜中氮或氨基酸含量

表觀(guān)消化率=100—{————————×————————————}×100

                  食糜中Cr含量      飼料中氮或氨基酸含量

內源性氮和氨基酸排出量的計算公式為：

                                                   飼料中鉻含量

內源性氮或氨基酸排出量 = 食糜中氮或氨基酸含量×—————————

                                                   食糜中鉻含量

真消化率的計算公式：

                         內源性氮或氨基酸排出量

真消化率= 表觀(guān)消化率 + ——————————————×100

                          飼料中氮或氨基酸含量

所有數據輸入數據庫中采用SPSS 11.0統計軟件進(jìn)行分析，比較轉基因大米和對照大米回腸末端氨基酸表觀(guān)消化率和真消化率的差異，以P<0.05為顯著(zhù)性檢驗水平。

對轉基因大米和親本大米中的蛋白質(zhì)、氨基酸、植酸等含量進(jìn)行了測定比較，結果表明轉基因大米和親本大米中以上各項的含量基本近似，如表1所示：

Table 1 The comparison of protein, amino acids, phytate content in GM and parental rice

 

     消化率可反映蛋白質(zhì)在體內消化酶作用下被機體分解的程度，以食入的氮或氨基酸量減去糞便中的量再除以食入量的百分率來(lái)表達。消化率包括表觀(guān)消化率和真消化率，兩者的區別在于是否考慮內源性氮或氨基酸排出量。如果不考慮內源性氮或氨基酸排出量，則為表觀(guān)消化率，反之則為真消化率。由于忽略了內源性排出量，表觀(guān)消化率常常低估了蛋白質(zhì)的消化，且常常隨蛋白質(zhì)攝入量的增加而增加，但由于其簡(jiǎn)單易行，故仍常用來(lái)評價(jià)食物中的蛋白質(zhì)質(zhì)量。真消化率則可較準確地評價(jià)蛋白質(zhì)的實(shí)際消化程度，且不受蛋白質(zhì)攝入高低的影響^[6]。表2結果顯示了兩種大米中蛋白質(zhì)和18種氨基酸的表觀(guān)消化率。

Table 2  Apparent digestibility of GM rice and parental rice （%）

       note：*means statistically significant in parental rice and rice genetically modified with cowpea trypsin inhibitor.

     由上表可見(jiàn)，轉基因大米和親本大米中蛋白質(zhì)的表觀(guān)消化率類(lèi)似，均在70%左右。各種氨基酸的消化率多介于60%~80%之間，除了轉SCK基因大米中賴(lài)氨酸的消化率與親本大米相比有顯著(zhù)差異外，其余17種氨基酸的表觀(guān)消化率未見(jiàn)明顯差別。

本實(shí)驗利用能完全吸收的5%水解酪蛋白飼料測定了受試動(dòng)物內源性氨基酸的排出量，以每攝入飼料中某氨基酸1kg時(shí)回腸食糜中所排出的相應氨基酸的g數表示，如表3所示：

Table 3：the endogenous amino acids flow (g/kg intake)

Note: “EF” means endogenous flow

將上述氨基酸排出量代入真消化率的計算公式，計算并比較轉基因大米和親本大米中各種氨基酸的真消化率，結果如表4所示：

Table 4：Ture digestibility of GM rice and parental rice（%）

        #: if the value is more than 100%, it is expressed as 100%。

      由表4結果可見(jiàn)，兩種大米中蛋白質(zhì)的真消化率均在90%以上，且兩者無(wú)明顯差別。除異亮氨酸真消化率值在轉基因大米和親本大米中均低于80%外，其余氨基酸的真消化率均在80%以上,在兩種大米間無(wú)明顯差別。

 

通過(guò)測定糞便（即肛門(mén)取樣法）中氮和氨基酸含量來(lái)評價(jià)蛋白質(zhì)和氨基酸消化率已經(jīng)受到了許多質(zhì)疑。主要原因是因為大腸中的微生物對未消化產(chǎn)物的發(fā)酵作用，影響了氮的排出量，Mason認為糞便中62%~76%的氮來(lái)自細菌^[6],結果導致高估了蛋白質(zhì)和氨基酸的生物利用率（約高5%~10%）。回腸末端取樣法可以解決這一方法上的缺陷。該法是通過(guò)外科手術(shù)在回腸末端造口或施以回-直腸吻合術(shù)，收集回腸消化液進(jìn)行測定，一般選用的實(shí)驗動(dòng)物是豬，在回腸末端做T型管，并開(kāi)口于體表，收集回腸消化產(chǎn)物進(jìn)行測定。經(jīng)大量實(shí)驗證明，回腸末端取樣法比肛門(mén)取樣法準確，可以更直觀(guān)地反映食物在小腸內的消化情況。

上述無(wú)論是肛門(mén)取樣還是回腸末端取樣，都需要收集動(dòng)物的全部消化產(chǎn)物進(jìn)行分析。但通常收集動(dòng)物的全部消化產(chǎn)物比較麻煩，也容易造成較大的實(shí)驗誤差。指示劑法可避免全收糞帶來(lái)的麻煩，比較省時(shí)省力。用做指示劑的物質(zhì)的選擇條件是必須不為動(dòng)物消化和吸收，在飼料和食糜中均勻分布并且有很高的回收率^[7]，一般可分為外源性指示劑和內源性指示劑。最常用的外源指示劑是三氧化二鉻（Cr₂O₃），文獻中國內外學(xué)者測定不同飼料中Cr₂O₃的回收率在85%~110%之間。

測定任何蛋白質(zhì)的真消化率，必須先測定出實(shí)驗動(dòng)物的內源性氮或氨基酸的排出量。國際上測定內源性氮或氨基酸排出量的方法有無(wú)氮飼料法、無(wú)氮飼料加靜脈平衡氨基酸法、同位素標記法、酶水解酪蛋白飼料法等。無(wú)氮飼料法是最經(jīng)典的測定內源性氮和氨基酸排出量的方法。但由于缺乏蛋白質(zhì)或肽對消化酶分泌的刺激作用，許多學(xué)者認為會(huì )低估氨基酸的排出量^[8]。國內外學(xué)者研究認為5%酶解酪蛋白從理論上可以完全吸收，且對消化道內源性氨基酸分泌的刺激作用明顯，可真實(shí)地反映機體內源性氨基酸的排出情況。

本研究采用實(shí)驗用豬為實(shí)驗動(dòng)物，采用回腸末端T-型瘺管術(shù)，三氧化二鉻作為指示劑，用5%酶解酪蛋白飼料測定該批動(dòng)物的內源性氨基酸排出量，并采用交叉法給動(dòng)物分別喂飼轉基因大米飼料和親本大米飼料，比較兩種大米氮和氨基酸表觀(guān)消化率和真消化率之間的差異。由表2和表4結果可見(jiàn)，轉基因和對照大米中氮或蛋白質(zhì)的表觀(guān)消化率在70%左右，真消化率則均在90%以上，比FAO/WHO1989年公布的《Protein quality evaluation》^[6]中列出的刨光大米真消化率為88%的值略高，可能是由于大米樣品的不同或代謝方法的不同所致；各種氨基酸的表觀(guān)消化率多分布于60%~80%之間，而真消化率則分布于80%~100%之間，且兩種大米中絕大部分氨基酸的表觀(guān)消化率和真消化率之間均無(wú)顯著(zhù)差異(P>0.05)，僅轉基因大米飼料的賴(lài)氨酸表觀(guān)消化率顯著(zhù)低于親本大米（P <0.05），但賴(lài)氨酸的真消化率兩者之間則無(wú)明顯差異。說(shuō)明轉基因大米與親本大米在蛋白質(zhì)和氨基酸消化率方面基本滿(mǎn)足實(shí)質(zhì)等同性的要求。賴(lài)氨酸表觀(guān)消化率的差異是否與轉入的外源基因表達的蛋白質(zhì)有關(guān)，則值得在今后的研究中進(jìn)一步探討和確定。

致謝：福建省農科院農業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗室王峰教授提供實(shí)驗用轉基因大米和對照大米材料，保證研究工作的順利完成，在此表示深深感謝。

 

1 霍啟光. 飼料生物學(xué)評定技術(shù)[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 1996. 120-126

2 GB/T5009.5-85. 食品中蛋白質(zhì)的測定方法[S]

3 GB/T 14965-1994. 食物中氨基酸的測定方法[S]

4 白露，張麗英，李德發(fā)，等. 鉻火焰原子吸收光譜法測定條件改善探討[J]. 中國飼料, 2002,  22：21-23

5 Sauer,W,C, M,Z Fan, R,Mosenthin et al. Methods for measuring ileal amino acid digestibility in pigs. In: Farm Animal Metabolism and Nutrition[M]. Eds: J.P.F.D’Mello. 2000. CAB International, 279-306

6 Protein quality evaluation. Report of a joint FAO/WHO expert consultation [M]. Bethesda, USA, 1989

7 楊鳳. 動(dòng)物營(yíng)養學(xué)[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1993. 167-171

8 Moughan PJ, Smith WC, Schrama J, et al. Chromic oxide and acid-insoluble ash as faecal markers in digestibility studies with young growing pigs[J]. J Agri Res, 1991,34:85-89

 

THE COMPARISON OF ILEAL DIGESTIBILITY OF PROTEIN AND AMINO ACIDS IN GM RICE AND PARENTAL RICE

【Abstract】 Objective: In order to compare the digestibility of protein and amino acids in parental rice and rice genetically modified with cowpeas trypsin inhibitor. Methods: 6 experimental swine were surgically fitted with simple T-cannula at the terminal ileum, and fed with parental rice and rice genetically modified with cowpeas trypsin inhibitor alternately, the ileum digesta were collected for determination of apparent and true digestibility of protein and amino acids. Results: The apparent and true digestibility of protein is similar in these two types of rice. Except the apparent digestibility of lysine, there are no statistically significant in the apparent and true digestibility of other 17 amino acids. Conclusion: The digestibility of amino acids is not changed by the insert of foreign gene, so it can meet the request of “substantial equivalence” in protein and amino acids digestibility.