楊曉光 毛德倩

中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 100050

 

摘要 目的：以檢測DNA為基礎，建立不同形式的食品中GMOs的適宜的定性和定量PCR檢測方法。方法：利用國際認可的含有GMOs準確含量的標準品-大豆和玉米粉（大豆標準品的GMOs含量分別為0%，0.1%，1%，2%，玉米標準品的GMOs含量為0%，0.1%，0.5%，2%），通過(guò)CTAB方法提取其基因組DNA，然后利用PCR擴增35S啟動(dòng)子和NOS終止子，以及大豆和玉米的house-keeping基因，來(lái)定性檢測GMOs，并檢測一部分豆制品和玉米制品；利用Real-time PCR來(lái)定量檢測未知含量的GMOs樣品。結果：（1）大豆和玉米的35S為195bp，不同含量的條帶呈現不同的亮度，從0.1%到2%成梯度，但0%也出現了條帶，利用XmnI內切酶酶切以后，35S條帶分為80bp和115bp兩條，而0%的條帶則沒(méi)有被酶切為兩條帶。NOS終止子經(jīng)過(guò)nested-PCR擴增出現為104bp的條帶。大豆和玉米的house-keeping基因分別為L(cháng)ec基因和IVR基因，PCR結果分別為414bp和225bp。（2） 大豆色拉油和玉米油的擴增結果相同，但大豆色拉油的Lec基因采取了nested-PCR擴增，得到118bp的片段。幾種豆制品經(jīng)過(guò)檢測不含有GMOs。（3）利用Real-time PCR方法測定了RR大豆和Bt176玉米的食品樣品各5種，得到的結果和美國的實(shí)驗室進(jìn)行對比，建立轉基因食品檢測的國際參比實(shí)驗室。  結論：通過(guò)本研究，可以得到如下結論：（1） 本研究對各種不同的植物食品的DNA提取方法進(jìn)行了改良，適合于后面要進(jìn)行的PCR擴增；（2）定性PCR方法用于檢測食品中的GMOs比較靈敏，其檢測限可以達到0,1%，但玉米的檢測效果不如大豆。（3）定量PCR方法，即Real-time PCR方法檢測食品中的GMOs非常靈敏，可以比較準確的對食品中的GMOs進(jìn)行定量。

 

利用現代生物工程技術(shù)使農作物增加產(chǎn)量和改良品質(zhì)是當前全球農業(yè)生產(chǎn)的重要途徑，也是解決和改善我國13億人口食物供應的重要策略。二十世紀九十年代中期以來(lái)，全球商品化轉基因作物的種植面積和產(chǎn)值成倍增長(cháng)。在食物作物方面，主要品種為抗除草劑大豆，抗蟲(chóng)BT玉米，抗除草劑油菜以及抗除草劑玉米等，于2000年達到4420萬(wàn)公頃^[1]。據預測，到2010年，轉基因作物的世界市場(chǎng)總收入將達到3萬(wàn)億美元，單是轉基因作物種子的收入就可以達到1200億美元。我國目前已進(jìn)入中間試驗和環(huán)境釋放階段的轉基因作物分別為48和49項；在食用作物方面，我國轉基因食物作物的研究進(jìn)展迅速，以糧谷類(lèi)為重點(diǎn)，包括水稻、小麥、玉米、大豆、花生、馬鈴薯等。其中已經(jīng)商品化的有耐儲存番茄、抗黃瓜花葉病甜椒雙豐R、抗黃瓜花葉病番茄PK-TMB805R、抗黃瓜花葉病番茄8805R等5種蔬菜。

 

隨著(zhù)轉基因作物商品化的發(fā)展，轉基因作物的食用安全性問(wèn)題日益受到各國政府、學(xué)術(shù)界和消費者的關(guān)注。人們所關(guān)注的主要問(wèn)題是由于轉入了外來(lái)基因，這些基因在作物中表達了新的蛋白質(zhì)，有可能引起作物成分及其安全性的改變，從而對人體健康造成潛在的危害。這是由于生物工程是一門(mén)新技術(shù)，目前的科學(xué)水平還難以精確地預測作物中引入外源基因后所造成的變化對人體健康的影響。這方面的不確定性和擔心必然會(huì )對轉基因作物的推廣應用造成障礙。目前，轉基因作物在歐洲遇到的阻力以及在某些東南亞國家政府中引起的擔心，已經(jīng)使這一新技術(shù)的發(fā)展和應用受到了明顯的限制。同時(shí)，各國消費者對此問(wèn)題的認識也存在著(zhù)較大的差異，目前，轉基因食品已經(jīng)引起了消費者的極大的關(guān)心和憂(yōu)慮。曾經(jīng)有一個(gè)調查，詢(xún)問(wèn)一些消費者他們是否會(huì )購買(mǎi)或者食用轉基因食品，大約有50%的被調查者給予了否定的回答，18%的被調查者說(shuō)他們缺乏這方面的信息，不能給予明確的回答，而28%的被調查者認為可能會(huì )食用，只有2%的被調查者給予了肯定的回答^[2]。目前，各國政府出臺的有關(guān)轉基因食品管理的政策和法規也很不相同。2000年1月在加拿大蒙特利爾召開(kāi)的聯(lián)合國基因改良食品會(huì )議上，130個(gè)國家的代表就“生物安全性議定書(shū)”草案達成了協(xié)議。然而，在制定轉基因食品的國際貿易規則方面，各國之間有很大的分歧。盡管，這種分歧不完全是對轉基因食品的安全性有不同的看法，其中摻雜了許多政治方面的因素；然而，我國已經(jīng)加入WTO，必然將面臨轉基因食品的貿易問(wèn)題。無(wú)論國際上爭論的結果如何，我國必須具備開(kāi)展轉基因食品的檢測和食品安全性評價(jià)的能力，以保護國家利益和人民健康。

 

那么，在現在的情況下，如何解決消費者普遍擔心的問(wèn)題呢？利用標簽對轉基因食品進(jìn)行說(shuō)明，讓消費者擁有知情權，是一個(gè)解決消費者憂(yōu)慮的方法。現在，已經(jīng)有135個(gè)國家在2000年1月對此已達成協(xié)議^[2]。如歐盟規定，食品中轉基因生物（genetically modified organisms, GMOs）的含量如果超過(guò)1%，就必須在標簽上做出標示^[3]。隨著(zhù)我國加入世界貿易組織（world trade organization，WTO），我國與其他國家之間的貿易會(huì )越來(lái)越多，食品貿易也會(huì )迅速增加，為了保護我國消費者的身體健康，解決國家之間可能的食品貿易糾紛，我們國家也已經(jīng)針對轉基因食品問(wèn)題制定了相應的法規，要求對食品中的GMOs存在與否進(jìn)行標示^[4]。這樣，就必須對食品中的GMOs進(jìn)行檢測，為我國制訂相應的法規提供技術(shù)支持，為制訂轉基因食品檢測的國家標準提供基礎，并為轉基因食品的情況進(jìn)行監督提供技術(shù)上的保障。本文即針對檢測的方法進(jìn)行研究，提出適宜的轉基因食品檢測方法。

 

對食品中的GMOs進(jìn)行檢測，目前主要采用兩種方法：一是基于DNA的檢測；二是基于蛋白的檢測。對轉基因食品的DNA進(jìn)行檢測，主要是利用PCR方法檢測轉入的外源基因片段；而蛋白檢測方法主要是檢測轉入的目的基因所表達的蛋白。基于DNA檢測的PCR方法靈敏度高，特異性強，檢測限可以達到0.1%^[5]，甚至更低，蛋白檢測方法對于不同形式的食品的檢測限不同，但不如PCR方法靈敏。但因為有的食品中不含有蛋白質(zhì)，有的不含有DNA或DNA含量極低，無(wú)法檢測，因此，這兩種方法可以互相補充。歐盟要求檢測食品中的GMOs時(shí)，這兩種方法都要采用^[5]。

現在，對食品中的GMOs的檢測大都采用PCR方法。由于大多數轉基因食品的基因都采用外源CaMV35S啟動(dòng)子和/或NOS終止子等公共基因元件，因此，在檢測食品中是否含有GMOs時(shí)，可直接檢測CaMV35S啟動(dòng)子和/或NOS終止子的存在與否，如果存在，即可說(shuō)明其中存在GMOs。目前，瑞典國家要求的GMOs檢測方法即是檢測35S啟動(dòng)子，如果食品中有可以檢測到的35S啟動(dòng)子，則該食品必須作出含有GMOs的標示^[6]。

 

 

結果：

CaMV35S啟動(dòng)子是一段長(cháng)195bp的堿基序列，如圖1，2所示，經(jīng)過(guò)PCR擴增以后，在凝膠電泳檢測中，其條帶位置在200bp左右。圖1中4，5，6泳道中RR大豆的含量分別為0.1%, 1%, 2%, 條帶亮度依次增強；圖2中4，5，6泳道中Bt-176玉米的含量分別為0.1%, 0.5%, 2%, 條帶亮度依次增強，說(shuō)明樣品中GMOs的含量依次增高。但兩圖中0%的泳道中也都出現了相同的條帶，這是CaMV35 S啟動(dòng)子擴增時(shí)出現的非特異性條帶，因此，35S 最終確定需要利用限制性?xún)惹忻竵?lái)進(jìn)行酶切。圖3和圖4是利用限制性?xún)惹忻笇?5S啟動(dòng)子進(jìn)行酶切，原先的195bp的條帶分成兩條，分別為80bp和115bp。在圖3中，泳道6在195bp 出現的條帶是由于酶切不完全造成的。

NOS終止子經(jīng)過(guò)nested-PCR擴增以后，為一段104bp的序列，如圖5 ，其條帶在100bp左右，由于NOS終止子采用了nested-PCR擴增的方法，其特異性很高，因此，可直接判斷此條帶即為NOS終止子的條帶。與CaMV35S啟動(dòng)子一樣，4，5，6泳道中條帶的亮度也依次增強，而泳道7 是一未知RR大豆準確含量的樣品。

IVR基因是玉米的house-keeping基因，是判斷所測樣品是否是玉米的特異性基因片段，其長(cháng)度為225bp, 如圖6，泳道3，4，5，6為玉米，其長(cháng)度大約在200bp左右；LEC基因是大豆的house-keeping基因，是判斷所測樣品是否是大豆的特異性基因片段，其長(cháng)度為414 bp，在圖6，泳道7，8，9，10是大豆條帶，大約在400bp左右。

圖7和圖8是對大豆色拉油和玉米油的35S進(jìn)行PCR擴增，其中圖7中的泳道10的大豆色拉油為GMOs陰性，其余各種油都為GMOs陽(yáng)性；圖9和圖10則是對35S啟動(dòng)限制性?xún)惹忻傅碾娪緢D，圖9中泳道1因為酶切不完全，所以在200bp左右還有條帶；圖11則是對11中GMOs陽(yáng)性的大豆色拉油進(jìn)行的NOS終止子的檢測的電泳圖，35S陰性的大豆色拉油沒(méi)有進(jìn)行NOS終止子的檢測；圖12是對大豆色拉油的house-keeping基因（Lectin基因）的檢測電泳圖；圖13是幾種豆制品的house-keeping基因（Lectin基因）的檢測電泳圖，這幾種豆制品不含有GMOs。

圖14是利用Real-time PCR對大豆色拉油的35S基因進(jìn)行定性檢測的結果，因為當時(shí)利用普通CTAB方法提取的大豆色拉油利用普通PCR擴增以后，凝膠電泳不能觀(guān)察到結果，因此便利用Real-time PCR對其進(jìn)行擴增，并得到了陽(yáng)性結果，說(shuō)明該色拉油含有GMOs。同時(shí)，說(shuō)明普通的CTAB方法不適合于植物油基因組DNA的提取。

表2為我們和農科院生物技術(shù)研究所同時(shí)利用PCR方法對市場(chǎng)上部分品牌的食用油中GMOs的檢測結果。我們共檢測了12種大豆色拉油合種玉米油，其中只有一個(gè)品牌的大豆色拉油不含有GMOs，而三個(gè)品牌的玉米油都含有GMOs。我們和農科院所檢測的相同品牌的大豆色拉油的結果完全一樣。

　DNA marker為100bp，1為空白對照， 2，3，4，5的RR大豆的含量分別為0％，0.1%, 1%, 2%。

 

圖2：Bt-176玉米的CaMV35S啟動(dòng)子PCR擴增

DNA marker為100bp，1為空白對照，2，3，4，5的Bt-176玉米的含量分別為0％，0.1% ，0.5%, 2%。

圖3：RR大豆的CaMV35S啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物酶切

泳道１為DNA marker(100bp)，2，3，4，5的RR大豆的含量分別為0％，0.1%, 1%, 2%。

圖４：Bt-176玉米的CaMV35S啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物酶切

DNA marker(100bp )，1，2，3，4的Bt-176玉米的含量分別0％，0.1% , 0.5%, 2%。

圖5：RR大豆的NOS 終止子的nested-PCR擴增

DNA marker為100bp，1為空白對照，2，3，4，5，的RR 大豆的含量分別為0％，0.1%, 1%, 2%，泳道6為一個(gè)含有RR大豆的未知含量的樣品。

圖6：RR大豆和Bt-176玉米的house-keeping基因PCR擴增

DNA marker為100bp，1為空白對照，2，3，4，5，的Bt-176玉米的含量分別0％，0.1% , 0.5%，2%；6，7，8，9，的RR 大豆的含量分別為0％，0.1%，1%，2%

圖7．大豆色拉油的CaMV35S啟動(dòng)子ＰＣＲ擴增

DNA marker為100bp，1為空白對照，2，3，4，5，6，7，8，9，10分別為9種大豆色拉油．

圖8：大豆色拉油和玉米油的CaMV35S啟動(dòng)子的PCR擴增

DNA Marker為100 bp，1為空白對照，2，3，4為大豆色拉油，5，6，7為玉米油，8為一個(gè)陽(yáng)性的玉米樣品

圖9：大豆色拉油的CaMV35S啟動(dòng)子ＰＣＲ產(chǎn)物酶切

DNA Marker為100bp，泳道1，2，3，4，5，6，7為7種不同的大豆色拉油

圖10：大豆色拉油和玉米油的CaMV35S啟動(dòng)子ＰＣＲ產(chǎn)物酶切

DNA Marker為100bp，泳道1，2，3，4為不同的大豆色拉油，5，6，7，為不同的玉米油

圖11：大豆色拉油的NOS 終止子的nested-ＰＣＲ擴增

    DNA Marker 為100bp，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11為不同的大豆色拉油，12為空白對照

圖12：大豆色拉油的Lec基因的PCR擴增

DNA Marker為100 bp，1為空白對照，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，為11種大豆色拉油

圖13：6種大豆制品的Lec基因的PCR擴增

DNA Marker為100bp，泳道1為空白對照，2，3為美國豆腐，4本地豆腐，5，6為美國的豆粉制品，7為中國的一種豆漿粉

 

表2：市場(chǎng)部分品牌大豆色拉油和玉米油GMOs檢測結果

 

 

說(shuō)明：我們共檢測了12種大豆色拉油和三種玉米油，除了一種大豆色拉油為轉基因陰性外，其他的全部為陽(yáng)性；圖中“+”代表轉基因陽(yáng)性，“—”代表轉基因陰性，空格代表沒(méi)有進(jìn)行檢測。

 

結果：

      圖15和圖18分別是大豆和玉米樣品利用Real-time PCR擴增時(shí)的Ct值與熒光強度圖。根據圖中熒光信號出現的早晚，即Ct值的大小可以定性地判斷不同樣品中GMOs的含量高低。

圖16是大豆樣品的溶解曲線(xiàn)圖，其中兩個(gè)峰值分別在87℃和89℃左右，分別代表了Lec基因和35S基因的溶解溫度，可以定性的判斷所檢測的樣品是否含有Lec基因和35S基因。圖19是玉米樣品的溶解曲線(xiàn)圖，其中兩個(gè)峰值的溫度非常接近，溫度在91℃和89℃左右，在圖上幾乎重疊，和大豆的相同，也可以定性的判斷樣品中是否含有IVR基因和35S基因。

圖17中的兩個(gè)圖分別是大豆樣品的Lec基因和35S基因的標準曲線(xiàn)圖，圖20則是玉米樣品的IVR基因和35S基因的標準曲線(xiàn)圖。其中食品樣品中的GMOs含量就是根據所測定的35S的含量與大豆和玉米的House-keeping 基因的含量的比值。

表3是我們自己利用Real-time PCR所檢測的大豆和玉米樣品中的GMOs的含量與美國實(shí)驗室所檢測同樣食品樣品的結果。

圖14：大豆Real-time PCR的Ct值和熒光強度圖

圖15：大豆Real-time PCR的溶解曲線(xiàn)圖

圖16：大豆Real-time PCR的標準曲線(xiàn)

圖17：玉米樣品的Real-time PCR的Ct值和熒光強度圖

  PCR擴增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩段分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅集團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接受到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，根據收集到的熒光信號就可以得知所要檢測的DNA的量了。

Ct值：在Real-time PCR中，Ct值是一個(gè)非常重要的參數，其含義是每個(gè)反應管中的熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系^[24]，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可以作出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可以從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數，進(jìn)而得到食品樣品中的GMOs的準確含量。

Real-time PCR的TaqMan熒光探針?lè )üぷ髟韴D

 

                  本研究利用PCR方法建立了食品中的轉基因組分（GMOs）的檢測方法，包括定性和定量的方法。定性采用普通的PCR或nested-PCR方法擴增，并采用限制性?xún)惹忻笇U增產(chǎn)物加以切割來(lái)進(jìn)一步驗證，以消除假陽(yáng)性和假陰性，檢測限可以達到0.1%；定量則采用Real-time PCR方法。并就各種不同食品中的DNA提取的CTAB 方法加以改良。在此基礎上，我們基本在轉基因食品方面建立一個(gè)國際參比實(shí)驗室。

1.        轉基因食品的定性檢測：

l        PCR擴增：對35S啟動(dòng)子和NOS終止子進(jìn)行PCR擴增，在本研究中，我們所檢測的結果與提供的標準品完全符合。對食品本身的特征性基因也進(jìn)行了擴增，以判斷該種食品來(lái)自于何種作物。同時(shí)，我們還需要對轉入的目的基因進(jìn)行檢測，以判斷所轉入的基因種類(lèi)。

l        利用限制性?xún)惹忻笇?5S啟動(dòng)子進(jìn)行酶切可以證實(shí)PCR擴增產(chǎn)物，nested-PCR方法也可以證實(shí)NOS終止子和Lec基因的存在。根據報道，普通PCE方法檢測存在一定的假陽(yáng)性率和假陰性率，因此，我們采用限制性?xún)惹忻负蚽ested-PCR方法即可以消除假陽(yáng)性和假陰性結果。

2.        轉基因食品的定量檢測：

l        Real-time PCR方法可以進(jìn)行轉基因食品的定量檢測，靈敏度高，特異性高，可以檢測食品中存在的很少的GMOs，操作方便，但代價(jià)高。以后還需要進(jìn)一步研究其它的定量PCR方法，如競爭性定量PCR。

3.        不同食品中的DNA提取的CTAB 方法的改良：

l        我們對不同食品，尤其是食用油的DNA提取方法進(jìn)行了改良。

 

 

 

Objective: Establishment of a series of qualitative and quantitative methods to detect the GMOs in different food matrix with the PCR based on DNA. Methods: Isolate the DNA of the standard samples of the Round-up Ready soybean and Bt-176 maize, which GMOs contents are known(soybean: 0%，0.1%，1%，2%; maize: 0%，0.1%，0.5%，2%) with the CTAB method, then amplify the 35S promoter and the NOS terminator inserted to modify the expression of the genes, and the house-keeping genes of the soybean and maize to detect the GMOs in food qualitatively; then detect some food samples with this method . Isolate DNA of the soybean and maize oils with the extraction kit. Detect some soybean and maize samples with the Real-time PCR quantitatively. Results: （1）The 35s promoter is 195 bp, the brightness of each lane is different because of their different GMOs contents. The GMOs negative samples also present a positive results, but the 35S promoter can be divided into two fragments of 80bp and 115bp with the XmnI restriction enzyme, the signal present in the negative samples can not be divided. The NOS terminator presents a 104bp signal with the nested-PCR. And the house-keeping gene of the soybean and the corn are Lectin gene and Invertase gene, which present 414bp and 225bp by the PCR amplification.（2）Some soybean salad oil and corn oil are detected with the PCR method, all samples but one are GMOs positive. To detect the house-keeping gene of the soybean salad oil, the nested PCR is used, and the Lectin gene presents a 118bp signal with the nested-PCR. Some kind of soybean products are also detected which are GMOs negative.（3）With the Real-time PCR, some samples which comprise soybean and corn contents are detected quantitatively, the results are compared with the results of the laboratory in U.S.A. and Singapore. Conclusions:（1）The DNA isolated with the method is suited to be amplified in the following PCR procedures, so the different DNA extraction methods in the text can be used in the GMOs detection. （2）The PCR method is sensitive to detect the GMOs in different food samples, which detection limit can be 0.1%. To the soybean and corn, the effect of detection of corn is not as good as of the soybean.（3）The Real-time PCR method is a sensitive method to detect the GMOs quantitatively with higher accuracy.