Effect  o f  different  diet  co mpo sitio ns  after  w eaning  o n bo dy  fat  co ntent  and ho rmo ne－sensitive lipase expressio n in rats fed w ith hig h－fat  diet 
                 Zhang Xiao－h(huán)ong Sun Chang－h(huán)ao Wang Xiao－chun Zhao Li－jun．
    The Department  of  Nutrition and Food Hygiene，Harbin Medical  University，Harbin，１５０００１，China．
    AbstractObjective To  study the effects of  different  diet  compositions  after  weaning on the body fat  content  and hor mone－sensitive lipase gene expression in rats fed with high－fat  diet．Methods  Male Wistar  rats weaned at ２４days were randomly divided into A，B，C，D groups  and were fed on high carbohydrate，i．e．basic di et ，high protein，high unsaturated fat  and high saturated fat  composition diet  respectively．After ３weeks，all rats were assigned to basic diet  for ２weeks later ，then rats from A group were randomly divided into A１and A２subgroups．A１subgroup was  fed on basic diet  continuously．A２subgroup with B，C，and D groups  was  assigned to high－fat  diet  for ６weeks．８rats from each group were sacrificed at  the end of  different  treatments to detect  body weight ，body fat  content  and blood glucose level．RT－PCR were used to determined the expres sion of  hormone －sensitive lipase in white adipose tissue．Results Body weight ，body fat  content  and blood glucose level  in C group were significantly lower  than that  in    斷乳后不同飼料構成對高脂膳食大鼠體重、體脂含量及HSL基因表達的影響    Effect  o f  different  diet  co mpo s itio ns  after  weaning  o n bo dy  fat  co ntent  and ho rmo ne－s ens itive lipas e expres s io n in rats fed with hig h－fat  diet A2subgoup on１１w（P＜０．０５）．
    The body weight ，body fat  content  in B２group were significantly lower  than that  in A２subgoup（P＜０．０５），but  blood glucose level  was  higher  than A２subgoup on１１w（P＞０．０５）．The body weight  in D group were significantly lower  than that  in A２subgoup（P＜０．０５），but  body fat  content  and blood glucose level was  no significantly lower  than A２subgoup on１１w（P＞０．０５）．The expression of  HSL in B２and C group was  higher  on９w and１１w respectively．The HSL mRNA level  in all groups  on３w were similar  to that  on１１w．Conclusions  Feeding on high unsaturated－fat  composition diet  after  weaning may significantly reduce the body weight ，body fat  content ，improve the abnormal  glucose metabolism in rats induced by high－fat  diet．It was  suggested that  the high unsaturated－fat  composition diet  can be reseanable for  weaned rats and gene expression regulation may be involved in programming obesity in adult－h(huán)ood by early nutrition．

    Keywordsweaning；diet  composition；HSL；RT－PCR

    肥胖與體內脂肪的沉積密切相關(guān)。動(dòng)物體內脂肪代謝處于動(dòng)態(tài)平衡之中，甘油三酯合成和分解的狀態(tài)及速度均影響體內脂肪的蓄積。激素敏感性脂肪酶（hormone －sensitive lipase，HSL）是甘油三酯水解過(guò)程中的限速酶，對于分解體內脂肪、降低體脂含量具有重要影響。近年的大量研究結果證實(shí)，生命早期（尤其是胎兒期和斷乳前后）的營(yíng)養狀況可以程序性影響成年期肥胖的形成。這些研究大多是從早期營(yíng)養不良和營(yíng)養過(guò)剩的角度進(jìn)行的，而早期不同飲食構成對成年期肥胖影響的資料則比較缺乏。不同類(lèi)型的脂肪在體內的代謝情況不同，如中鏈脂肪在體內容易被氧化，還能夠增加能量消耗，增加飽腹感     ；長(cháng)鏈多不飽和脂肪可以抑制機體的脂肪從頭合成   。我們分別以含長(cháng)鏈不飽和脂肪達５０％左右的大豆色拉油和中鏈飽和脂肪含量達５０％左右的椰子油構成不飽和脂肪與飽和脂肪飼料。動(dòng)態(tài)研究了斷乳后不同飼料構成包括高碳水化合物、高蛋白、高不飽和脂肪和高飽和脂肪構成飼料對大鼠體重、體脂含量和激素敏感性脂肪酶基因表達的影響，以明確斷乳后不同飼料構成對高脂膳食大鼠體重和體脂含量的影響并探討其機制。現報道如下。

    １材料與方法
 
    １．１實(shí)驗動(dòng)物及分組：

    成年Wistar 大鼠，雌性２００只（２３０－２５０g），雄性１００只（２８０－３００g），購于北京維通利華實(shí)驗動(dòng)物有限公司，一級動(dòng)物。在實(shí)驗室內適應一周后，進(jìn)行交配。新生雄性幼鼠于出生后２４天斷乳，按體重隨機分為A、B、C、D４組，其中A組４８只，B組、C組和D組各３２只動(dòng)物。自由飲水，每周稱(chēng)體重一次。A、B、C、D４組動(dòng)物分別給予高碳水化合物、高蛋白質(zhì)、高不飽和脂肪和高飽和脂肪供能比飼料。人為控制加食量，使各組每只動(dòng)物的平均攝食量分別為體重的９％、９％、７．８９％、７．８９％。這樣對于體重相同的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，無(wú)論食用哪種飼料，均能攝入相同的蛋白質(zhì)（高蛋白組除外）、混合無(wú)機鹽、混合維生素、纖維素，并使體重相同的動(dòng)物，攝入的能量相同。３周后，所有動(dòng)物均轉為基礎飼料（即為高碳水化合物供能比飼料）自由進(jìn)食。２周后，再將A組按體重隨機分為A１、A２兩組，A１組繼續給予基礎飼料，A２組與B組、C組和D組則給予高脂飼料，繼續喂養６周。A１組作為正常對照組，A２組作為高脂對照組。

    １．２飼料：

    實(shí)驗所用飼料為純合成飼料，基礎飼料參照美國營(yíng)養協(xié)會(huì )推薦的AIN－９３G實(shí)驗動(dòng)物合成飼料配方配制而成，在此基礎上適當調整蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪的含量配制出高蛋白質(zhì)、高脂肪和高能飼料。飼料所含的營(yíng)養素和能量能夠保證動(dòng)物生長(cháng)發(fā)育的基本需要。飼料中主要營(yíng)養素的含量及三大生熱營(yíng)養素的供能比見(jiàn)表１。

    １．３組織材料制備：

    分別于不同構成飼料末期、轉為基礎飼料末期、高能飼料喂養４周末和６周末（即為實(shí)驗的３周末、５周末、９周末和１１周末），每組隨機選取８只動(dòng)物，戊巴比妥那麻醉，腹主動(dòng)脈采血，檢測血脂；取睪周和腎周脂肪稱(chēng)重記錄，并留取睪周脂肪迅速放入液氮中冷凍以備檢測mRNA。

    １．４體脂含量（％）的計算：

    體脂含量（％）＝［睪周脂肪重量（g）＋腎周脂肪重量（g）］體重（g）×１００％

    １．５HSL mRNA的測定：

    按GIBCO公司總RNA提取試劑盒操作步驟，從１００－g大鼠脂肪組織中提取總RNA。逆轉錄反應以總RNA２μg為模板。HSL、β－actin基因采用oligo（dT）為逆轉錄引物，加入逆轉錄酶AMV１０U，總反應體積為２０μl，４２℃水浴２h，合成第一條cDNA鏈；PCR反應以逆轉錄產(chǎn)物２．０μ１為模板，引物序列見(jiàn)表２。加入引物２０pmol ，TagDNA聚合酶０．３５μl，總反應體積為２５μl。PCR擴增條件：β－actin為９４℃變性３０s 、５０℃退火２min、７２℃延伸４０s ，３０個(gè)循環(huán)；HSL為９４℃變性３０s ，６０℃退火６０s ，７２℃延伸４５s ，３５個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)２％瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定之后，在數字成像儀上照相、掃描分析。

    １．６結果分析：

    運用SPSS軟件包，數據以均數士標準差異（X±s）來(lái)描述，組間差異采用方差分析進(jìn)行處理。

    ２結果 
  
    ２．１斷乳后不同飼料構成對大鼠體重、體脂含量及血糖水平的影響：由表３可見(jiàn)，實(shí)驗前體重各組之間無(wú)差異（P＞０．０５）。在實(shí)驗末期，高脂對照組體重、體脂肪含量顯著(zhù)高于正常對照組（P＜０．０５）。而斷乳后給予高蛋白質(zhì)構成飼料的B組、高不飽和脂肪飼料的C組和高飽和脂肪飼料的D組，體重均顯著(zhù)低于高脂對照組A２（P＜０．０５）。其中C組的體脂含量和血糖水平均顯著(zhù)低于高脂對照組A２（P＜０．０５）；而B(niǎo)組的體脂含量盡管明顯低于A(yíng)２組（P＜０．０５），但血糖水平并未改善且高于高脂對照組A２；D組的體脂含量與高脂對照組A２相比，無(wú)顯著(zhù)差異（P＞０．０５）。

    ２．２斷乳后不同飼料構成對大鼠脂肪組織激素敏感性脂肪酶基因表達的影響：為消除系統誤差，我們對RT－PCR產(chǎn)物吸光度進(jìn)行掃描獲得峰面積，用HSL與β－肌動(dòng)蛋白的峰面積比值反映HSL基因表達水平。在實(shí)驗的第３周，斷乳后高不飽和脂肪組WAT HSL表達升高，而高蛋白質(zhì)組、高飽和脂肪組降低。動(dòng)態(tài)觀(guān)察發(fā)現，在整個(gè)實(shí)驗進(jìn)程中，高不飽和脂肪組的HSL mRNA表達水平持續升高（如圖３），在第３周和第１１周（見(jiàn)圖１～２）明顯高于其他各組。

    ３討論  
 
    越來(lái)越多的研究證實(shí)，生命早期的營(yíng)養狀況對人體物質(zhì)代謝有終生性影響，對成年期肥胖等慢性疾病的發(fā)生具有重要意義。流行學(xué)病調查資料顯示，胎兒期營(yíng)養不良的低出生體重兒，成年時(shí)肥胖危險增加；出生體重高的兒童成年時(shí)也容易發(fā)生肥胖；而母乳喂養對成年期肥胖有一定的預防作用。實(shí)驗動(dòng)物研究發(fā)現，孕鼠妊娠期間能量攝入受限，后代的體重和體脂肪含量較正常對照高１０％～２０％；哺乳期間過(guò)度喂養的仔鼠在成年時(shí)也容易發(fā)生超重，１９６６年McCance進(jìn)行的一項實(shí)驗提供了有力的證據。他通過(guò)調整每窩中剛出生的仔鼠數量形成大窩和小窩喂養，發(fā)現大窩組體重一直都低于小窩組。這些研究結果表明，生命早期是生長(cháng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，同時(shí)也是產(chǎn)生代謝程序性影響的敏感時(shí)期，這一時(shí)期營(yíng)養素對機體的刺激可能被機體“記憶”下來(lái)，從而持續影響個(gè)體的生長(cháng)發(fā)育及成年期疾病的發(fā)生。１９９２年Lucas ７    將這種早期飲食對代謝的持續終生性影響定義為營(yíng)養程序化。可見(jiàn)，尋找一種合理的早期飲食結構對于早期預防肥胖等疾病具有重要意義。我們研究了斷乳后攝入不同構成飼料，包括高碳水化合物、高蛋白質(zhì)、由不飽和脂肪含量較高的大豆色拉油構成的高不飽和脂肪和大豆色拉油和椰子油配伍形成的高飽和脂肪飼料，對大鼠再進(jìn)食高脂膳食時(shí)體重、體脂含量及脂肪組織中激素敏感性脂肪酶表達的影響，期望能夠找到一種較為合理的斷乳后飲食結構。結果發(fā)現，高蛋白、高不飽和脂肪、高飽和脂肪組大鼠的體重明顯降低，其中高蛋白組大鼠的體脂含量明顯降低，但血糖水平未被改善反而升高；高飽和脂肪組大鼠的體脂含量和血糖水平均未被明顯改善；而高不飽和脂肪飼料組的體重、體脂含量和血糖均得到了顯著(zhù)改善。已知由肥胖并發(fā)糖尿病等癥的危險與肥胖者體內脂肪含量過(guò)高密切相關(guān)，控制體脂肪含量可以顯著(zhù)緩解肥胖并發(fā)其他疾病的危險。因此，本研究結果提示，高不飽和脂肪構成飲食是較為合理的動(dòng)物斷乳后飲食。
    通過(guò)對不同處理階段脂肪組織HSL的表達水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀(guān)察，我們發(fā)現實(shí)驗末期高不飽和脂肪組體脂含量明顯降低，可能與該組HSL基因表達水平持續升 高有關(guān)；而高飽和脂肪組體脂含量較高可能與該組HSL基因表達水平持續較低有關(guān)。提示，斷乳后不同飼料構成可能通過(guò)持續影響HSL基因表達，影響高脂膳食大鼠的體脂含量及體重，進(jìn)而程序性影響的肥胖發(fā)生。支持Lucas 提出的早期營(yíng)養環(huán)境可能持續影響基因表達，進(jìn)而影響成年疾病的發(fā)生的假說(shuō)。

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