學(xué) 術(shù) 報 告 廳

譯者：王　騁 （哈爾濱醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院，哈爾濱　１５０００１）
　　
圍生期脂類(lèi)代謝的研究模型——研究圍生期營(yíng)養不良的長(cháng)期效應
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
  摘 要：通過(guò)對大鼠使用不同的實(shí)驗設計，我們可以回答圍生期脂類(lèi)代謝變化造成的短期或長(cháng)期影響的幾個(gè)沒(méi)有得到答案的問(wèn)題。首先，可以說(shuō)明懷孕的前半期母體脂肪蓄積的重要性，在這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期胎兒的發(fā)育是緩慢的，營(yíng)養不良影響脂肪庫的蓄積，不但限制了子宮內的發(fā)育而且有長(cháng)期的影響，如成年后的葡萄糖耐量降低。其次，哺乳期的營(yíng)養不良可以產(chǎn)生降低體重的長(cháng)期效應，即使斷奶后食物的攝入恢復正常也不能改變這種效應。我們的發(fā)現也表明在懷孕期和哺乳期豐富的ｎ－３系列脂肪酸攝入會(huì )對子代的發(fā)育有不良的影響，但一些交叉的喂養試驗表明這種影響的產(chǎn)生是由哺乳期而不是懷孕期攝入豐富的ｎ－３脂肪酸造成的。在懷孕期和哺乳期食用富含ｎ－３脂肪酸飲食的母鼠子代１０周時(shí)的血糖／胰島素的關(guān)系發(fā)生了改變，既然富含ｎ－３系列脂肪酸的飲食會(huì )降低哺乳期母乳的分泌量，那么通過(guò)進(jìn)行一些附加的的實(shí)驗來(lái)確定是否減少食物的攝入或改變飲食的脂肪酸構成或者兩者都改變會(huì )對葡萄糖／胰島素中樞有長(cháng)期的影響。結果：表明在哺乳期降低ｎ－３脂肪酸的飲食攝入而不是乳構成的變化在出生后１６周時(shí)會(huì )造成胰腺（葡萄糖應答）胰島素敏感性降低。結論：目前的研究表明在懷孕早期母乳脂肪蓄積受損以及哺乳期食物的攝入而不是飲食脂肪酸的構成不同對出生后的發(fā)育和成年鼠的葡萄糖／胰島素關(guān)系有主要的影響。
  關(guān)鍵詞：懷孕；營(yíng)養不良；大鼠；魚(yú)油飲食；橄欖油飲食；哺乳；出生后發(fā)育；胰島素；葡萄糖
１ 前言
  胎兒期及新生兒期生長(cháng)發(fā)育的受損增加了日后成人２型糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等慢性疾病的易感性３, １５。早期營(yíng)養影響生長(cháng)發(fā)育，它可以使身體構成、生理、新陳代謝等發(fā)生與之適應的并且是永久的變化１４。懷孕期，胎兒可以利用的營(yíng)養素是依靠透過(guò)胎盤(pán)從母體循環(huán)中獲得。在考慮倫理和方法局限性的基礎上，需要找到恰當的實(shí)驗模型來(lái)確定母體的營(yíng)養素在懷孕期和哺乳期發(fā)生了怎樣的變化而導致了子代發(fā)育和成年疾病的易感性的提高。我們使用了不同的實(shí)驗設計以大鼠作為實(shí)驗對象來(lái)研究母體營(yíng)養素在圍生期的變化對脂類(lèi)代謝、出生后的發(fā)育結果、改變葡萄糖／胰島素的關(guān)系易感性的影響。
２ 母體在懷孕前半期營(yíng)養不良
而導致的短期和長(cháng)期影響

  懷孕時(shí)，對母體的營(yíng)養觀(guān)念不但應考慮母親的飲食而且應該包括她的機體構成和新陳代謝。母體為了保證胎兒對基質(zhì)的利用而改變自己的新陳代謝與之適應，在這期間脂類(lèi)代謝扮演了一個(gè)重要的角色７, ８。母體組織內脂肪庫的堆積是懷孕期持續的一種特征１１, １２, １９，它主要發(fā)生在妊娠的前半期，對懷孕后期的胰島素抵抗起相反作用時(shí)，甚至可以提高脂肪組織對胰島素的敏感性１７。母親在懷孕早期脂肪積累能力的降低會(huì )導致甲狀腺功能減退，這種減退會(huì )使懷孕后期正常的分解代謝產(chǎn)生特殊適應及使胎兒發(fā)育受損４, ５。因而，可以假設在懷孕早期母親脂肪的蓄積在胎兒營(yíng)養素的利用和后來(lái)的生長(cháng)發(fā)育及健康上扮演了一個(gè)關(guān)鍵的角色。我們通過(guò)確定大鼠懷孕前半期營(yíng)養不良的效應來(lái)研究這種可能性，從而來(lái)避免母親脂肪堆積而導致子代短期及長(cháng)期的效應。
  按年齡對雌性大鼠匹配進(jìn)行配對，當陰道液體顯微鏡的涂片中出現精子時(shí)（懷孕的第０天），它們被分成兩組。其中一組（對照組）自由攝食而另一組的攝食量是這一組的６０％（營(yíng)養不良組）。這種喂養條件持續到懷孕后的第１２天，從懷孕初期到此時(shí)對照組的體重增加了６８．９±１．５ｇ，而營(yíng)養不良組增加了１６．３±４．１ｇ（ｐ＜０．００１）。這種發(fā)現表明了營(yíng)養不良的孕鼠增加脂肪的能力，既然在這個(gè)懷孕期胎兒－胎盤(pán)結構（孕體）很小１０，那么母體在懷孕早期體重的增加主要是源于脂肪的蓄積９。從懷孕的第１２天開(kāi)始，不限制所有大鼠進(jìn)食，兩組母鼠的體重都平行的增加，到懷孕的第二十天，對照組的體重增加是１６２．６±４．８ ｇ，而營(yíng)養不良組是１１３．１±４．５（ｐ＜０．００１）。因而，因懷孕早期喂養不足而導致脂肪庫的蓄積受損并不因為懷孕后期喂養條件恢復正常而恢復。
  在分娩時(shí)，懷孕早期營(yíng)養不良組每窩存活的新生鼠的數量及其體重都顯著(zhù)低于對照組，這個(gè)發(fā)現表明盡管在懷孕早期胎兒發(fā)育的較小，但是母親在這個(gè)特殊階段的脂肪庫蓄積的受損導致了對子宮內發(fā)育的損害，這些結果在出生時(shí)都可以看到。
  在哺乳期，懷孕早期營(yíng)養不良組和對照組的幼仔都由他們的媽媽分別隨意喂養，我們發(fā)現到斷乳時(shí)（出生后２１天）兩組的幼仔都有相似的體重，這一發(fā)現指出在懷孕早期母體營(yíng)養不良對子宮內胎兒的發(fā)育所造成的消極影響通過(guò)在哺乳期自由攝食而改善。
  為了確定是否母體懷孕早期營(yíng)養不良對胰島素－葡萄糖中樞產(chǎn)生了長(cháng)期的影響，當幼仔１６個(gè)周大時(shí)，對它們進(jìn)行了口服葡萄糖耐量試驗，給予２ｇ葡萄糖ｋｇ體重，然后在０, ５, １０, １５, ２０, ３０, ４５, ６０ｍｉｎ收集尾部血液，然后計算６０ｍｉｎ內血漿胰島素、葡萄糖曲線(xiàn)下的面積，相應的比值可以在圖１中看到。我們可以清晰地看到所有幼仔在母體懷孕早期限制了食物攝入的成年雄性和雌性大鼠都出現糖耐量受損的現象，這些可以在胰島素和葡萄糖比值曲線(xiàn)下面積比值的顯著(zhù)增加中反映出來(lái)。
  因而，目前的發(fā)現顯示在懷孕前半期母體的營(yíng)養不良不但對子宮內胎兒的發(fā)育有消極的影響，而且對成年后糖耐量受損有長(cháng)期的影響。

圖１、給懷孕期間隨意進(jìn)食的對照組和懷孕前半期限制飲食的營(yíng)養不良組（食物的攝入在懷
孕的前１２天是對照組的６０％）的子代在１６周進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗（２ｇ糖ｋｇ），上圖是血
漿胰島素曲線(xiàn)下面積ＡＵＩ和葡萄糖曲線(xiàn)下面積（ＡＵＧ的比值，口服葡萄糖耐量試驗方法
學(xué)的細節取自以前的文獻１３。在營(yíng)養不良組和對照組之間的統計比較：＝ｐ＜０．０５，＝ｐ＜０．００１。

３ 出生后早期營(yíng)養不良的長(cháng)期
影響
  既然在哺乳期的營(yíng)養不良可能對發(fā)育和葡萄糖胰島素關(guān)系產(chǎn)生負面的影響，那么我們也應該用一種動(dòng)物模型來(lái)驗證這種可能性。為了降低乳類(lèi)的攝入，未經(jīng)過(guò)處理的子鼠分成兩窩，一窩１６只（限食組），另一窩９只（對照組）。斷奶時(shí)（出生后第２１天），限食組（一窩有１６個(gè)仔鼠）的體重低于對照組（ｐ＜０．００１），表明了限食組限制了母乳的攝入。從這時(shí)不再控制所有幼仔的進(jìn)食，但是在１６周時(shí)，顯示哺乳期限食組體重低于對照組，這意味著(zhù)限食組在斷乳后恢復正常飲食體重也趕不上對照組。

在１６周時(shí)，按照上面提到的相同方法進(jìn)行了口服葡萄糖耐量試驗，如圖２所示，在哺乳期限食組（包括雄性和雌性）胰島素曲線(xiàn)下面積同葡萄糖曲線(xiàn)下面積的比值同非限食組相比更高。有趣的是對于子代的口服葡萄糖耐量受損程度，哺乳期限食同懷孕早期〔圖１〕限食相比要小一些。
４ 調整懷孕期和哺乳期飲食中
脂肪酸構成的短期和長(cháng)期效應

  基于上面的研究結果，我們要確定是否大鼠在懷孕期和哺乳期脂肪酸的攝入變化會(huì )影響子代的發(fā)育結果。因此，雌鼠從交配到哺乳期結束無(wú)限制的食用一種半合成的飲食，這種飲食中包含作為非維生素脂肪成分的１０％魚(yú)油（ＦＯＤ）或橄欖油（ＯＯＤ），這種飲食構成如文獻所述１, ２，并且在圖３中也可以看到它們的脂肪酸比例， ＦＯＤ同ＯＯＤ相比，ω－３脂肪酸占較高的比例（二十碳五烯酸和二十二碳不飽和脂肪酸，ω－３的比例分別是２０∶５和２０∶６），但是十八碳烯－９－酸的比例（１８∶１）較低一些。

出生時(shí)，喂食魚(yú)油的子代新生鼠體重低于喂食橄欖油的新生鼠（ｐ＜０．０１），在哺乳期這種差別（把每窩的幼仔數調整到８只，排除進(jìn)食量的影響）得到加強，而且就像已經(jīng)被指出２的喂食魚(yú)油的幼仔體重的增加和意識反射的形成被延遲了。在圖４中可以看出，喂食魚(yú)油的母鼠的泌乳量要低于喂食橄欖油的母鼠。因而，母鼠喂食魚(yú)油脂肪酸構成的不同和泌乳量的下降導致了子代出生后發(fā)育的延緩。
  我們還要確定是否這兩組出生后發(fā)育的不同是由于母鼠在懷孕期或哺乳期飲食類(lèi)型的不同而造成的。因而，設計了一個(gè)交叉喂養實(shí)驗，在懷孕期喂養魚(yú)油的子代新生兒由喂養橄欖油的母鼠喂養（ＦＯＤ－

ＯＯＤ），另一組是（ＯＯＤ－ＦＯＤ）。作為比較，我們也研究幼仔的另外兩種情況，即ＯＯＤ－ＯＯＤ和ＦＯＤ－ＦＯＤ，在圖５中顯示了哺乳期反映意識運動(dòng)反射（ａｉｒ ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ， 形態(tài)正向反射）強度的指數。我們可以看到懷孕期喂食ＦＯＤ而哺乳期喂食ＯＯＤ母鼠的仔鼠同全程喂食ＯＯＤ母鼠的仔鼠相比意識活動(dòng)的反射值相同。然而，在ＦＯＤ－ＯＯＤ組和ＦＯＤ－ＦＯＤ組都觀(guān)察到意識活動(dòng)的反射值出現了降低。

這些發(fā)現表明哺乳期比懷孕期的飲食中脂肪酸構成不同對出生后的發(fā)育影響更大，盡管在懷孕期食物的攝入量在ＦＯＤ和ＯＯＤ兩組間沒(méi)有什么不同，也可能是飲食脂肪酸構成的變化和哺乳期泌乳量減少的共同效應影響了在哺乳期飲食中含ＦＯＤ母鼠的子代的發(fā)育。
５ 大鼠哺乳期飲食脂肪酸不同
構成的長(cháng)期影響

  通過(guò)對上一部分發(fā)現的總結，我們決定來(lái)確定是否強化ω－３脂肪酸和哺乳期的營(yíng)養不良兩種因素一起對葡萄糖／胰島素中樞有長(cháng)期的影響。為了這個(gè)目的，我們把分別以ＦＯＤ和ＯＯＤ喂養的分別限制在每窩８只的幼仔從斷乳起隨機進(jìn)食，結果發(fā)現在雄性的第７周和雌性的第１０周以ＦＯＤ喂養的母鼠的子代體重降低，并且在日后的口服葡萄糖耐量實(shí)驗中血漿葡萄糖水平兩組增加的程度也相似，但是以ＦＯＤ喂養母鼠的子鼠同以ＯＯＤ喂養（母鼠）的子鼠相比血糖水平增加的要少一些。因而鑒于這兩組血漿葡萄糖曲線(xiàn)下的面積比較接近，但是以ＦＯＤ喂養的母鼠的子鼠（包括雄性和雌性）胰島素變化的曲線(xiàn)下的面積顯著(zhù)低于以ＯＯＤ喂養（母鼠）的子鼠（ｐ＜０．０５），這表明可能存在胰島細胞分泌受損或者胰島素的敏感性升高或者兩者都有。

   既然喂食ＦＯＤ的母鼠的泌乳量降低而引起仔鼠攝食量的降低或者母乳中增加的ω－３脂肪酸這兩個(gè)因素可能導致了子代口服葡萄糖耐量實(shí)驗結果的變化（從上面可以看到），那么進(jìn)行了兩個(gè)附加的實(shí)驗來(lái)驗證這兩個(gè)因素的可能性。
  第１個(gè)實(shí)驗，食用ＯＯＤ母鼠的幼仔（在哺乳期每窩有８個(gè)仔鼠，對照組）同食用ＦＯＤ母鼠的仔鼠（在哺乳期每窩有１６個(gè)幼仔，限食組）相比較。從圖６可以看出，在斷乳時(shí)，限食組的體重要顯著(zhù)低于對照組。從這時(shí)開(kāi)始，所有的幼仔都隨機食用固定配方的食物。在１６周時(shí)，哺乳期限食組（包括雄性和雌性）的體重低于對照組（統計上有顯著(zhù)差異）。這些哺乳期限食組（包括雄性和雌性）和對照組幼鼠的口服葡萄糖耐量實(shí)驗的結果都有相似的增加，但是限食組增加的較少一些（圖７），這說(shuō)明攝食量的降低導致了成年后糖負荷更低的胰島素釋放。這種發(fā)現同以前的文獻２１相符合，顯示了大鼠（哺乳期限食） 胰腺葡萄糖應答的持續降低。

第２個(gè)實(shí)驗，目的是為了確定在哺乳期總攝食量不變的前提下強化ω－３脂肪酸攝入是否對葡萄糖／胰島素中樞有長(cháng)期的影響。為此，懷孕期食用普通飲食的母鼠仔鼠被分成２組，一組（每窩有８只幼仔）由以添加１０％橄欖油（是唯一的非維生素脂肪）的半合成飲食飼喂的母鼠哺乳，另一組（每窩有４只幼仔）由除了１０％橄欖油變成１０％魚(yú)油其他同上面相同飲食喂養的母鼠哺乳。在兩組中，哺乳期高峰（１５ｄ）每窩的泌乳量都很相似，并且斷乳時(shí)體重沒(méi)有差別，表明兩組的營(yíng)養條件基本上是相同的。由表８可以看出，以ＦＯＤ喂食的母鼠同以ＯＯＤ喂食的母鼠分泌的母乳有較高的ω－３脂肪酸和較低的油酸（１８∶１），因而兩組在哺乳期食物攝入相同但是飲食中脂肪酸的構成不同。從斷乳開(kāi)始到１６周，不限制兩組幼鼠進(jìn)食（食物是普通的鼠食），在１６周時(shí)兩組的體重沒(méi)有差別，并且兩組（ＯＯＤ－８和ＦＯＤ－４）的口服糖耐量實(shí)驗（２ｇｋｇ）中血漿葡萄糖和胰島素的增加也是相似的，以上提到的比較包括所有的雄鼠和雌鼠。實(shí)際上ＯＯＤ－８和ＦＯＤ－４組的胰島素和葡萄糖曲線(xiàn)下的面積的比值是相似的，即使如上文所述母鼠在圍生期營(yíng)養不良導致的子代葡萄糖耐量實(shí)驗的變化只是暫時(shí)的和短暫的，屬于成年早期（６－１２周）糖耐量的提高，到４４周時(shí)已經(jīng)降低到正常，甚至到１５個(gè)月時(shí)會(huì )低于正常１６。目前的發(fā)現指出在沒(méi)影響哺乳期食物攝入量的前提下，飲食脂肪酸構成的變化對體重沒(méi)有短期或長(cháng)期的影響，對葡萄糖／胰島素關(guān)系也沒(méi)有長(cháng)期的影響。