Functions of Antioxidant Activity and Angiotensin I Converting Enzyme (ACE) Inhibitory
Activity of Sufu Fermented Extracts
汪立君李里特
（中國農業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養工程學(xué)院，北京，100083）

 

摘要：用清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基能力表示腐乳提取物的抗氧化能力。中國市售15種腐乳的水提取物的抗氧化活性為11.72%-100.80%，ACE的抑制活性為0.71-1.94mg/mL。

關(guān)鍵詞：腐乳；抗氧化性；ACE抑制活性

Abstract: The antioxidative activity of sufu extracts was determined by the capacity of scavenging 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical. After extraction, the antioxidative activity and the ACE inhibitory activity of 15 kinds of sufu from the markets was determined. The antioxidative activity of water extracts from 15 kinds of sufu were from 1172% to 10080%, and the ACE inhibitory activity of 15 kinds of sufu water extracts were from 071 to 194 mg/mL.
Keywords: Sufu; Antioxidative activity; ACE inhibitory activity

    我國傳統的大豆制品包括經(jīng)微生物發(fā)酵制成的各種發(fā)酵制品，如醬油、豆醬、豆豉、腐乳和發(fā)酵豆乳飲料等。這些發(fā)酵豆制品不僅營(yíng)養豐富，而且還含有許多具有生理功能作用的活性物質(zhì)。現代研究表明大豆發(fā)酵食品具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化、抗菌等生理功能。最近，人民越來(lái)越注重食品的保健功能，特別是食品的抗氧化功能和降血壓功能。大豆及大豆制品中含有多種抗氧化成分，除少量的生育酚和維生素C外，大豆中含有的黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)化合物，以及在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多肽類(lèi)和褐色色素類(lèi)物質(zhì)等都具有抗氧化的活性。

    許多的研究證明，大豆發(fā)酵制品比沒(méi)發(fā)酵之前顯示更強的抗氧化活性［1］。JoanHwa Yang等［2］(2000) 研究表明發(fā)酵的大豆汁(fermented soybean broth)比沒(méi)發(fā)酵的顯示更強的對1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基的清除作用。Esaki等［3］（1994）報告了日本豆醬（miso）、納豆（natto）和天培（tempeh）在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了抗氧化的成分。而對我國的發(fā)酵大豆制品—腐乳的抗氧化活性的研究還很少。關(guān)于腐乳的降血壓功能Yasuda等［4］(2000)研究了日本的豆腐乳的功能，倪莉［5］（1997）認為在腐乳的水溶性成分中含有ACE抑制活性肽，但沒(méi)有對其活性的大小進(jìn)行評價(jià)。

    腐乳是我國具有民族特色的傳統大豆發(fā)酵制品，是由豆腐坯經(jīng)微生物（霉菌或細菌）發(fā)酵而成的。各地人民依據自己的不同口味，形成了各具地方特色的傳統產(chǎn)品，如黑龍江克東腐乳、北京王致和腐乳、浙江紹興腐乳、廣西桂林腐乳和云南路南腐乳，以及其他各地生產(chǎn)的腐乳等，以不同的生產(chǎn)配料，形成了各具地方特色的傳統食品。一般根據豆腐坯是否有微生物繁殖而分為腌制型和發(fā)霉型兩大類(lèi)。發(fā)霉型又分為天然接種和純種培養兩種，依據豆腐坯培菌的菌種不同，還可分為毛霉型、根霉型和細菌型。

    根據腐乳的分類(lèi)，我們調查了中國具有代表性的腐乳15種，對它們的抗氧化活性和降血壓功能進(jìn)行了評價(jià)。通過(guò)本項研究，可以揭示腐乳作為功能性食品深度利用的可能性,也有助于改善其加工過(guò)程，進(jìn)而生產(chǎn)高活性的腐乳，也有望從腐乳中開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)品。

1 實(shí)驗材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

    15種的腐乳樣品分別購于各地超市（品牌，產(chǎn)地見(jiàn)表2）。
    有機自由基：1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，Sigma，美國；
    抗氧化劑：α-生育酚(α-Tocoperol)，Wako,日本；
    2-(N-嗎啉代)乙基磺酸（MES），Sigma，美國；
    馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL），Sigma，美國；
    血管緊張素轉換酶（ACE），Sigma，美國；
    OPA(O-phthaldialdehyde)，色譜純，Sigma。
    其他試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗儀器

    RF5300PC－熒光分光光度計，Shimadzu，(日本)。
    紫外可見(jiàn)分光光度計，1240，Shimadzu(日本)。
    多用振蕩器，MS-1，Shimadzu(日本)。
    臺式離心機，TCL-16C，上海安亭儀器廠(chǎng)。

2 實(shí)驗方法

2.1 樣品的預處理

    將購得的腐乳樣品，分別去除湯汁和外表面，取其中間固體狀部分，真空冷凍干燥、磨碎、用正己烷脫脂后，置于瓶中密閉備用。

2.2 提取液的制備

    取處理過(guò)的樣品各0.24g加入6mL（40mg樣品/mL）的蒸餾水，在室溫下浸提1h，并間歇振蕩。將其在3000rpm下，離心10min，后取上清液，備用。

2.3 抗氧化活性的測定

    有機自由基DPPH消去能力的測定參照須田郁夫［6］的方法進(jìn)行修改。利用DPPH溶液的特征紫紅色團的吸收峰，以分光光度法測定待測樣品后在520nm處的吸光值表示其對有機自由基的清除能力。

    待測樣品溶液的配置：取上述各樣品的提取液1.5mL，加入1.5mL，0.2mol MES緩沖液和3.0mL乙醇混合作為待測樣品；200μmol DPPH溶液的配置：400μmol DPPH/無(wú)水乙醇溶液和0.2mol MES緩沖液(pH6.0)混合；按表1進(jìn)行加樣，混合均勻，于室溫下放置20min，然后在520nm下測定其吸光值。每一吸光值平行測3次，取其平均值。清除率按下式計算：清除率=（1-Ai-Ai〖〗A0)×100%

2.4 ACE活性的測定［7］

    ACE抑制活性的測定參照血壓下降機能評價(jià)法［7］。對ACE抑制率達到50%時(shí)的抑制劑濃度即為半抑制濃度，記為IC50。
   

3實(shí)驗結果和討論

3.1 腐乳的抗氧化性

    正如表2中所示，所有的樣品都表現出了抗氧化的功能。一些蔬菜和魚(yú)類(lèi)中含有大量的具有抗氧化和清除自由活性的成分。據報導卷心菜和中國大白菜中都顯示出較強的清除自由基的活性，分別相當于0.75和0.25mg VE/g（鮮重）［8，9］。魚(yú)類(lèi)中除cutlassfish外，大多數的活性范圍在0.25～2mg VE/g之間（鮮重）［10］。因此我們可以認為腐乳水萃取物中有較強的清除DPPH自由基活性的物質(zhì)。
   

   腐乳在發(fā)酵過(guò)程中，大豆異黃酮由糖甙向甙元轉化［11］。Esaki等［3］（1994）報告了日本豆醬（miao）、納豆（natto）和天培（tempeh）在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了抗氧化的成分，他們的研究結果證明了在日本豆醬（miao）和天培（tempeh）中起抗氧化作用的主要物質(zhì)是黃豆甙元（daidzein）和染料木黃酮（genistein）。這兩種的異黃酮都是在他們的發(fā)酵過(guò)程中由相應的糖甙：大豆甙（daidzin）和染料木甙（genistin）產(chǎn)生的。Hirota等［12］(2000)報告在日本豆醬（miso）中8-hydroxydaidein(8-OHD)和8-hydroxygenistein(8-OHG)對DPPH自由基的清除作用與維生素E相當。韓北忠［13，14］的研究表明在腐乳熟成60天，所有的大豆蛋白亞基消失（含鹽量8%和11%），熟成80天（含鹽量8%）有大約27%的氮以氨基酸的單體存在，余下的氮以多肽或氨基酸降解產(chǎn)物存在。Yasuda［15-19］的研究認為在日本腐乳主要由大豆蛋白的11S堿性亞基和分子量在11-15kDa的多肽組成。而范俊峰［20］報道用胃蛋白酶水解的大豆分離蛋白，在水解4h的水解產(chǎn)物清除DPPH自由基作用最強，達到3.21mg VE/大豆分離蛋白。因此在腐乳水萃取物中起抗氧化活性的物質(zhì)還有待進(jìn)一步的分離和鑒定。

3.2 腐乳的ACE抑制活性

    所有的樣品的都顯出ACE抑制活性。由于品種和地區的差異，其IC50值不同。與表2相比較，腐乳的IC50值大于日本的腐乳樣品，既其ACE抑制活性小于日本的腐乳樣品，這樣的比較只是粗略的，因為作者沒(méi)有詳細寫(xiě)出樣品的準備過(guò)程及測定的方法，如果要比較中日兩國的腐乳的值需要用同樣的實(shí)驗方法測定樣品。

    許多的研究已經(jīng)證明，大豆的多肽具有ACE抑制活性。1995年，Shin等［21］研究了韓國豆醬中分離出的大豆ACEI肽，其半抑制濃度(IC50值)是2.2μg/mL。吳建平等［22-24］系統研究了蛋白酶水解大豆蛋白所得到的ACEI肽，其水解物上清液的IC50值為1.20mg/mL，有一定的降壓效果。倪莉［5］（1997）認為在腐乳的水溶性成分中含有ACE抑制活性肽。Kuba等［4］(2000)等人從日本的豆腐乳中提取和分離了ACE抑制活性肽。

    腐乳是豆腐的發(fā)酵制品，在發(fā)酵過(guò)程中大豆蛋白發(fā)生水解，生成氨基酸和多肽，這也是腐乳具有獨特風(fēng)味和質(zhì)構的根本原因。韓北忠［13-14］的研究表明在腐乳熟成60d，所有的大豆蛋白亞基消失（含鹽量8%和11%），熟成80d（含鹽量8%）有大約27%的氮以氨基酸的單體存在，余下的氮以多肽或氨基酸降解產(chǎn)物存在。Yasuda等［15-19］的研究認為在日本腐乳主要由大豆蛋白的11S堿性亞基和分子量在11-15kDa的多肽組成。因此，在此相的研究中，我們認為腐乳水萃取物的ACE抑制功能的主要成分有可能是多肽，還需要進(jìn)一步的研究以證實(shí)。

    在所選定的腐乳樣品的水提取物中其抗氧化和ACE抑制活性顯著(zhù)不同。這些不同很可能與加工過(guò)程有很大的關(guān)系，例如：所用的微生物的類(lèi)型、發(fā)酵時(shí)間以及整個(gè)制作程序的差異等等。在這個(gè)研究中沒(méi)有對提取物中起作用的活性物質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)一步的分離、確認并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗加以確認是非常必要的。從本研究，我們可以看出腐乳作為功能性食品開(kāi)發(fā)具有廣闊的前景。

    從不同地區的超市購得的樣品，由于腐乳的制作的原料來(lái)源，制作工藝等的不同，給各品種的比較帶來(lái)困難，若獲得真正有價(jià)值的結果，還是自己制作樣品為好。當大范圍篩選樣品時(shí)，因為需要樣品的種類(lèi)很多，做到這點(diǎn)不容易；但是對個(gè)別樣品進(jìn)行深入研究時(shí)，就必須按照規范取樣和處理。

參考文獻:

1Fukushima D Recent progress in research and technology on soybean Food Sci Technol Res, 2001, 7:8-16.
2Yang JH, Mau JL, Ko PT. Antioxidant properties of fermented soybean broth. Food Chem, 2000, 71:249-254.
3Esaki H, Onozaki H, Osawa T. Antioxidative activity of fermented soybean products. Food Phytochemicals for Cancer Prevention I Acs Symposium Series, 1994, 546:353-360.
4Kuba M and Yasuda M. Angiotensin IConverting Enzyme Inhibitory Peptides from Tofuyo (Fermented Soybean Cheese). Proceedings of The Third International Soybean Meeting in Japan, (2000):256-257.
5倪莉等，腐乳中生理活性多肽的分離和表征浙江農業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，23（5）:93-97.
6Suda. In “The methods of food functions analysis”, ed. by K. Shinohara, T. Suzuki and S. Kaminogaw, Korin, Japan,  (2000):218-220(in Japanese).
7Horie H, In “Handbook of Functional Evaluation on Food” Japanese Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries. Agriculture, Forestry and Fishery Research Council. National Food Research Institute.  (1999):117-121(in Japanese).
8W Bors, Saran M. Radical scavenging by flavonoid antioxidants. Free Radical Res Commun, 1987, 2:289-294.
9Hertog MGL, Feskens EJM, Hollman PCH, et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: The Zutphen elderly study Lancet, 1993, 342:1007-1011.
10Khanum M N, Yamaguchi T, Hiroishi S. et al. Radicalscavenging activity of fish and fishery products. Food Sci Technol Res, 1999, 5(2):193-199.
11張曉峰，李里特，李再貴等 腐乳發(fā)酵過(guò)程中大豆異黃酮變化的研究中國釀造，2002，122（6）：17～20.
12Hirota A, Taki S, Kawaii S, Yano M. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical-scavenging compounds from soybean miso and antiproliferative activity of isoflavones from soybean miso toward the cancer cell lines. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000, 64(5):1038-1040.
13Han B Z, Rombouts F M and Nout MJR. Sufu-A Chinese fermented soybean food. Int Jo Food Microbiol, 2001, 65:1-10.
14Han B Z, Rombouts F M and Nout M J R. Microbiological safety and quality of commercial sufu- a chinese fermented soybean food. Food Control, 2001, 12:541-547.
15Yasuda M, Sakaguchi M, Otonari H, Okuhama S, Kinjyo S and Hongo F. The role of microorganismus during dehydration of tofu cubes. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1992, 39:870-877(in Japanese with English summary).
16Yasuda M, Matsumoto T, Sakaguchi M and Kobamoto N. Change in chemical components of tofuyo prepared by Monascus fungus during fermentation. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1993, 40:331-338(in Japanese with English summary).
17Yasuda M, Matsumoto T, Sakaguchi M and Kinjo S. Changes in protein and nitorogen compounds of tofuyo prepared by Aspergillus oryzae during fermantation. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1994, 41:184-190(in Japanese with English summary).
18Yasuda M, Matsumoto T, Sakaguchi M and Kinjo S. Production of tofuyo using the combination of red and yellow kojis, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1995, 42:38-43(in Japanese with English summary).
19Yasuda M, Kinjyo S and Miki E. Changes in breaking characteristics, creep behavior during fermentation, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 1996, 43:322-327(in Japanese with English summary).
20范俊峰，大豆蛋白抗氧化多肽及降血壓多肽的研究［D］ 北京：中國農業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養工程學(xué)院，200314 .
21Shin, Z.I., Ahn, C.W., Nam, H.S., Lee, H.J., Lee, H.J., Moon, T.H. Fractionation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from soybean paste. Korean J. Food Sci.Technol., 1995, 27:230-234.
22吳建平，丁霄霖，大豆降壓肽的研究（Ⅰ）－生產(chǎn)高活性ACEI肽酶篩選，中國油脂，1998,23（2）,49-51.
23吳建平，丁霄霖，大豆降壓肽的研究（Ⅱ）－酶E的作用條件的優(yōu)化，中國油脂，1998,23(3),6-8.
24吳建平，丁霄霖，大豆降壓肽的研究（Ⅲ）－酶E水解進(jìn)程參數的研究，中國油脂，1998,23(4),12-16.