摘要： 目的探討不同濃度硫辛酸對視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化損傷的保護作用。方法在培養的ARPE19細胞中預先加入不同濃度的硫辛酸，然后換成含一定濃度的丙烯醛，測定其對細胞生存率、線(xiàn)粒體膜電位及細胞內氧化和抗氧化能力的影響。結果：與50μM丙烯醛組比較，預先在A(yíng)RPE-19細胞中加入100μM LA和300μM LA 48h能明顯提高細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位，增加細胞內SOD和GSH-Px活性，降低ROS含量；而預先加入1-10μM LA沒(méi)有這種保護作用。結論一定濃度硫辛酸對50μM丙烯醛造成的ARPE-19細胞氧化損傷有明顯的保護作用。
關(guān)鍵詞：硫辛酸；丙烯醛；視網(wǎng)膜色素上皮細胞；氧化損傷

老年黃斑變性 (agerelated macular degeneration, AMD) 是一種隨年齡增加而發(fā)病率上升并導致雙眼中心視力進(jìn)行性下降的疾病，它是西方國家55歲以上人群的主要致盲眼病［1］。隨著(zhù)我國經(jīng)濟發(fā)展，人口老齡化已經(jīng)成為主要的社會(huì )問(wèn)題，AMD將成為我國老年人口中的常見(jiàn)病和多發(fā)病。最近來(lái)自上海某地區的調查表明，在被調查的50歲以上人群中，AMD的患病率為155%［2］。由于A(yíng)MD具體病因和發(fā)病機制尚不清楚，目前尚無(wú)有效的治療方法，因此，預防AMD的發(fā)生是非常重要的。許多研究表明，氧化應激在A(yíng)MD的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［3,4］，因此，有關(guān)氧化應激、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）細胞氧化損傷與AMD發(fā)生關(guān)系的研究成為當前的熱點(diǎn)之一，同時(shí)尋找有效的抗氧化劑也成為研究AMD的另一個(gè)新熱點(diǎn)。本實(shí)驗將使用丙烯醛(Acrolein)作為氧化劑，硫辛酸（аlipoic acid, LA）作為抗氧化劑研究其對RPE細胞的損傷與保護作用，為探討AMD的發(fā)生機制，尋找預防AMD發(fā)生和發(fā)展的新方法提供參考資料。
1 材料與方法
11 主要試劑和儀器
丙烯醛(Sigma)，а硫辛酸（德國Klaus Wessel贈送），培養液：DMEM-F12（Sigma，含10%胎牛血清，100U／mL 青霉素和100 (g／ml鏈霉素）；胰蛋白酶EDTA（Sigma），分光光度掃描儀和熒光光度掃描儀（美國奧克蘭研究所營(yíng)養與代謝中心Ame-s實(shí)驗室）。其它所有試劑除特殊標志外，均為Sigma公司。
12方法
121 藥品配制LA和丙烯醛分別溶于PBS中，а硫辛酸配成儲備液，保存在4℃冰箱中，丙烯醛于每次實(shí)驗使用前現配制。
122 細胞培養及分組人類(lèi)ARPE19細胞系（Dr Nancy J Philp贈送），分別按05×106、0.05×106和0.1×106的細胞密度種植于100mm2培養皿、96孔和6孔細胞培養板中，置37℃、5%CO2培養箱內。在培養過(guò)程中，每3~4天換培養液一次，倒置顯微鏡下觀(guān)察，選生長(cháng)狀況良好并貼滿(mǎn)培養瓶或培養板底部80%左右的細胞，施加以下處理因素同時(shí)分組如下。實(shí)驗組：將不同濃度丙烯醛（0、1、10、25、50、100 μmol／L）分別加入ARPE19細胞培養液中培養24h。干預組：將不同濃度LA（0、1、10、100、300μmol／L）預先加入到ARPE19細胞培養液中，培養48h后，再換成含丙烯醛（濃度為50μmol／L）的培養液培養24h。以上實(shí)驗每個(gè)濃度組均設3個(gè)平行樣，且每個(gè)實(shí)驗至少重復2-3次。
123 細胞存活率測定：實(shí)驗結束后，96孔培養板每孔加入20μl (5mg／ml) MTT溶液，繼續培養3小時(shí)后，棄去培養液，加入100μl的DMSO，37℃下放置10min，混勻后555nm下測量OD值。
124 細胞線(xiàn)粒體膜電位測定［5］：實(shí)驗結束后，96孔培養板每孔加入100μlJC1（濃度為2μg／ml，Molecular Probes公司）繼續培養30min，然后用細胞培養液沖洗二次，再每孔加入100μl細胞培養液，用多孔熒光計數儀（Wallac 1420; PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA) 分別在485nm 激發(fā)光和535nm、590nm 發(fā)射光下測定紅、綠色熒光強度，以紅／綠熒光比值代表細胞線(xiàn)粒體膜電位。
125 細胞內ROS測定：6孔培養板培養的ARPE19細胞，在實(shí)驗結束后，每孔加入25μM DCFHDA(2'-7'-dichlorofluorescin, DCFH)1ml，37℃放置30min，然后用冰涼的PBS沖洗三次，加入裂解液在冰浴上放置15min，收集細胞并低溫（4℃）離心（15000g）10min，在485 nm激發(fā)光和535nm發(fā)射光下測定上清液熒光強度，細胞內ROS水平以相對DCF熒光值／μg蛋白質(zhì)（(BCA 方法測定)來(lái)表示。
126 細胞內SOD和GSHPx測定：6孔培養板培養的ARPE19細胞，在實(shí)驗結束后，用冰涼的PBS沖洗三次，分別按試劑盒(Cayman Chemical公司)要求收集細胞，破碎細胞，-70℃儲存備測。
2 結果
21 不同濃度丙烯醛對ARPE-19細胞生存率和線(xiàn)粒體膜電位的影響不同濃度丙烯醛（0、1、10、25、50、100μM）分別與ARPE-19細胞作用24h后，通過(guò)MTT和JC1分析結果顯示：與對照組比較，0.25μM丙烯醛對ARPE-19細胞的存活率和線(xiàn)粒體膜電位沒(méi)有影響，但50μM和100μM丙烯醛使細胞存活率分別下降到154%和110% (P＜0.01，圖1)；使線(xiàn)粒體膜電位分別下降了65.6%和68.7%（P＜0.01，圖2）。

22 LA對ARPE19細胞氧化損傷的保護作用含不同濃度LA的培養液預先與ARPE19細胞作用48h后，再換成含50μM丙烯醛的培養液作用24h，通過(guò)MTT和JC1分析結果顯示：0300μM LA對ARPE19細胞沒(méi)有影響，但100300μM LA對50μM丙烯醛造成的細胞存活率下降和線(xiàn)粒體膜電位下降有明顯的保護作用（P＜001），110μM LA卻沒(méi)有顯示這種保護作用(P＞005，見(jiàn)圖3，圖4）。

23 LA和丙烯醛對ARPE19細胞氧化和抗氧化能力的影響與對照組比較，50μM丙烯醛與ARPE19細胞作用24h后，能明顯引起細胞內ROS增高（P＜0.01），抗氧化酶SOD和GSHPx活性下降（P＜0.01）。100-300μM LA能明顯拮抗50μM丙烯醛對ARPE19細胞造成的氧化損傷作用，即降低ROS水平（P＜0.01），提高SOD和GSHPx活性（P＜0.01）。雖然1.10μM LA有拮抗丙烯醛造成的ARPE19細胞GSHPx下降的能力（P＜0.01），但對丙烯醛造成的ARPE19細胞氧化損傷沒(méi)有顯示明顯保護作用 (P＞0.05，見(jiàn)表1)。

3 討論
ARPE19細胞是人類(lèi)二倍體RPE細胞系，在體外能很好的表達RPE細胞的許多特性，因此在眼病研究中被廣泛使用［5］。由于RPE細胞含有大量的光敏感物質(zhì)，經(jīng)常暴露于陽(yáng)光下，尤其是每天需要吞噬含有大量不飽和脂肪酸的光感受器外段膜片，因此RPE細胞對氧化應激非常敏感。隨著(zhù)年齡增高，機體和RPE細胞抗氧化能力下降，與 RPE細胞氧化損傷有關(guān)的老年眼病發(fā)病率也逐年增高。
目前認為AMD發(fā)生機制的一個(gè)假設是氧化應激對RPE細胞造成的氧化損傷。有文獻報道：不同氧化劑引起的RPE細胞損傷類(lèi)型不同，因此不同的抗氧化劑也顯示了對RPE細胞的不同保護能力［3］ 。本實(shí)驗結果顯示：50μM丙烯醛與ARPE19細胞作用24h，可以使細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位明顯下降，細胞內ROS水平增高，SOD和GSHPx活性下降。預先在A(yíng)RPE19細胞中加入100μM LA和300μM LA 48h能明顯拮抗丙烯醛對細胞產(chǎn)生的氧化損傷作用，實(shí)驗結果顯示，LA的這種保護作用主要通過(guò)提高ARPE19細胞內SOD和GSHPx活性，降低ROS水平實(shí)現的。而預先加入110μM LA卻沒(méi)有這種保護作用，雖然110μM LA也能提高GSHPx活性，但對SOD活性沒(méi)有明顯的影響，因此，對丙烯醛引起的細胞內ROS水平增高也沒(méi)有降低作用。提示：在丙烯醛引起的ARPE19細胞氧化損傷中SOD起重要作用，推測丙烯醛造成ARPE19細胞氧化損傷中以超氧陰離子（O2-）為主。

線(xiàn)粒體膜電位下降被認為是細胞凋亡的早期指標之一。本實(shí)驗結果顯示：50μM丙烯醛能引起ARPE-19細胞線(xiàn)粒體膜電位明顯下降，細胞存活率明顯降低，提示：丙烯醛造成細胞死亡可能是通過(guò)引起ARPE19細胞線(xiàn)粒體損傷進(jìn)行的。線(xiàn)粒體是細胞中最容易受到氧化損傷的細胞器。許多研究表明，線(xiàn)粒體氧化損傷在衰老和與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［7］。最近研究指出，與正常同齡人相比，AMD患者RPE細胞線(xiàn)粒體數量降低、體積減小、嵴丟失、基質(zhì)密度下降、并且線(xiàn)粒體的這種改變伴隨著(zhù)明顯RPE細胞內脂褐質(zhì)增多［8］。體外試驗指出，丟失線(xiàn)粒體功能的RPE細胞、可以使與脂質(zhì)轉運功能有關(guān)、與炎癥和氧化應激有關(guān)的核基因表達上調，因此加速了脂褐質(zhì)在RPE細胞內的堆積以及RPE細胞的氧化損傷［9］。由于RPE細胞內脂褐質(zhì)堆積是AMD發(fā)生的早期病理現象之一，提示RPE細胞線(xiàn)粒體功能障礙在早期A(yíng)MD發(fā)生中起重要作用。丙烯醛是煙草中主要氧化物質(zhì)之一，大量流行病學(xué)調查表明，吸煙是導致AMD發(fā)生和進(jìn)一步惡化的最主要危險因素［10］。通過(guò)本實(shí)驗提示，與吸煙有關(guān)的AMD發(fā)生機制可能與吸煙造成RPE細胞線(xiàn)粒體氧化損傷有關(guān)。
LA是線(xiàn)粒體靶抗氧化劑和線(xiàn)粒體營(yíng)養素［11］，本實(shí)驗結果顯示：LA在100μM -300μM范圍內對ARPE19細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位均沒(méi)有產(chǎn)生任何影響，但對丙烯醛造成的ARPE-19細胞氧化損傷卻有明顯的保護作用，也進(jìn)一步表明RPE細胞線(xiàn)粒體氧化損傷可能在A(yíng)MD發(fā)生中起重要作用。
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