摘要：目的觀(guān)察攝入不同劑量硫辛酸對D半乳糖致過(guò)氧化損傷小鼠海馬細胞DNA的影響。方法清潔級雌性昆明種小鼠按體重隨機分為五組，除空白對照組外，其余四組用D-半乳糖頸背部皮下注射，，每日一次，連續6周，其中一組為模型組，余三組為硫辛酸干預組，經(jīng)口給予不同濃度硫辛酸，空白組、模型組給予同體積溶劑，同時(shí)，模型對照組和硫辛酸干預組繼續給予相同劑量的D-半乳糖頸背部皮下注射。連續8周。干預結束后，采用單細胞凝膠電泳法檢測和評價(jià)各組小鼠海馬細胞DNA損傷。結果模型組小鼠海馬彗星細胞尾長(cháng)、尾矩、Olive尾矩均最大，對照組的均最小，對照組和模型組比較有統計學(xué)意義（P＜0.05），干預組各指標均小于模型組（P＜0.05）,有統計學(xué)意義。
關(guān)鍵詞：硫辛酸；小鼠；D-半乳糖；DNA損傷；單細胞凝膠電泳

1965年Harman提出衰老的自由基理論認為衰老是細胞成分積累性氧化損傷的結果，是由自由基反應引起的，自由基反應參與環(huán)境、疾病和遺傳控制的衰老過(guò)程有關(guān)的衰老性改變。〔1］對機體有較好的抗氧化作用有數百種抗氧化劑，但是似乎只有五種是網(wǎng)絡(luò )抗氧化劑：維生素C(VC)、維生素E(VE)、輔酶Q10(CoQ10)、硫辛酸(LP)和谷胱甘肽(GSH)。機體不能產(chǎn)生VC 和VE，必須從食物中獲得。機體可以自行產(chǎn)生GSH、LP和CoQ10，但體內這些抗氧化劑的水平隨著(zhù)年齡的增長(cháng)而下降。〔2］
硫辛酸天然存在于大多數原核、真核微生物及動(dòng)植物體內，因此人群膳食中大多含有硫辛酸，其富含于高代謝率的動(dòng)物組織如心、肝、腎，非動(dòng)物性組織中含量高的有菠菜、甘藍、西紅柿、豌豆等。〔3］在體內硫辛酸是一種輔酶，和碳水化合物的氧化利用有關(guān)，是線(xiàn)粒體生產(chǎn)ATP過(guò)程中必不可少的，在線(xiàn)粒體內被降解為二氫硫辛酸，抗氧化功能更強大。〔4］
關(guān)于硫辛酸的研究?jì)热菽壳耙褟哪芰看x方面轉向其抗氧化功能及在多種疾病中的防治作用。我國對硫辛酸的研究不多，本研究以單細胞凝膠電泳［5］為手段觀(guān)察硫辛酸對D半乳糖致過(guò)氧化損傷小鼠海馬神經(jīng)元細胞DNA斷裂修復的影響效應。為其在氧化損傷相關(guān)疾病中的應用提供科學(xué)依據。
1 材料與方法
11 儀器與主要試劑：DYY—III型電泳槽(北京市六一儀器廠(chǎng))；DYY—11B型三恒電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng))；BH—2型熒光顯微鏡(OLYMPUS)；數碼相機(Nikon)，低熔點(diǎn)瓊脂糖，正常熔點(diǎn)瓊脂糖，溴化乙錠等（Sigma），其余均為優(yōu)級純。
12 實(shí)驗方法
121 實(shí)驗動(dòng)物及處理：18-22克清潔級雌性昆明種小鼠50只（購于福建醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心）按體重隨機分為五組，除空白對照組外，其余四組用D半乳糖100mg／kg BW頸背部皮下注射，注射量為0.1ml／10g，每日一次，連續6周，其中一組為模型組，余三組為硫辛酸干預組，經(jīng)口給予不同濃度硫辛酸（50mg／kg BW 100mg／kg BW 200mg／kg BW），空白組、模型組給予同體積溶劑(市售菜子油,經(jīng)高溫及無(wú)水乙醇處理 0.05ml／10gBW)，同時(shí)，模型對照組和硫辛酸干預組繼續給予相同劑量的D半乳糖頸背部皮下注射。連續8周。
122 單細胞懸液的制備：小鼠最后一次處理后禁食24小時(shí)，然后脫頸處死，于冰臺上取腦之后立即剝離海馬，用預冷生理鹽水小心洗去浮血，和預冷的PBS緩沖液（1ml）混合用勻漿器輕輕將組織磨碎制得海馬細胞懸液，立即與預溫37℃的0.7％。低熔點(diǎn)瓊脂糖以1：1例混勻。
123 制膠片：分作2層．第l層為正常熔點(diǎn)瓊脂糖層，取自制微電泳槽，將預熱45℃的0.8％正常熔點(diǎn)瓊脂糖的PBS滴在槽內，每槽0.1ml，放入4℃冰箱固化15分鐘后取出，將0.1ml含細胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖均勻滴在槽內即制好第二層，再放入4℃冰箱固化15分鐘。
124 細胞裂解：微電泳槽從冰箱取出后水平浸入當天配制的4℃細胞裂解液中1h。
125 DNA堿解旋：微電泳槽取出，置于水平電泳槽中,新配制的堿性電泳緩沖液覆蓋玻片，放置20分鐘。
126 電泳：電壓25V，電流300mA,電泳20分鐘。
127 中和：電泳結束后取出放入干凈平皿，緩緩加入HCl(PH7．5)緩沖液，將，將微電泳槽淹沒(méi)15分鐘，冰箱保存，中和兩次。
128 脫水：吸去中和液，緩緩加入無(wú)水乙醇，將微電泳槽淹沒(méi)10分鐘，取出，放干燥處過(guò)夜，第二天收起保存［6］。
129 染色與觀(guān)察：在膠面上滴2—3滴EB水溶液，10分鐘后，用雙蒸水浸泡漂洗掉膠面上的EB染液，每個(gè)樣本隨機選擇30個(gè)彗星細胞拍照。
13 圖像分析：用CASP軟件［7］逐個(gè)分析細胞，取尾長(cháng)、尾矩（從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部DNA含量的乘積、Olive尾矩（從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積）這三個(gè)指標進(jìn)行統計分析。
14 統計學(xué)處理：用SPSS11-5軟件進(jìn)行方差分析。
2 結果
21 各組小鼠海馬彗星細胞各指標平均值見(jiàn)下表，可見(jiàn)模型組小鼠海馬彗星細胞尾長(cháng)、尾矩、Olive尾矩均最大，對照組的均最小，對照組和模型組比較有統計學(xué)意義（P＜0.05），干預組各指標均小于模型組（P＜0.05）,有統計學(xué)意義。
22 各組彗星細胞圖像：

3討論
適當濃度的自由基在信號傳導途徑中扮演著(zhù)重要角色，高濃度的自由基及其衍生物對機體有很大的危害性，它們損傷所有的細胞組分，對蛋白質(zhì)，核酸，脂質(zhì)等大分子進(jìn)行氧化攻擊，已證實(shí)過(guò)度的自由基牽涉到如下疾病的致病機理：癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、風(fēng)濕性關(guān)節炎、缺血再灌注損傷、阻塞性睡眠呼吸暫停等。上述疾病多是老年慢性相關(guān)疾病，Harman認為衰老的機制至少有部分是有自由基引起的［1］。

隨著(zhù)年齡的增加，線(xiàn)粒體功能衰退，細胞呼吸過(guò)程產(chǎn)生的自由基增多，對線(xiàn)粒體本身及細胞的破壞加劇。同時(shí)，機體的抗氧化系統效率降低，進(jìn)一步導致能量代謝障礙和氧化損傷。所有老年性機體有必要補充抗氧化劑以增加內源性抗氧化劑效率，阻止自由形成或猝滅自由基。
D半乳糖致小鼠過(guò)氧化損傷可能是通過(guò)羰氨反應,形成交聯(lián)產(chǎn)物,通過(guò)羰基毒化機制致使小鼠體內蛋白質(zhì)功能喪失,進(jìn)而引起一系列的病理改變。交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)一步降解可生成丙二醛等不飽和醛酮中間產(chǎn)物,因而小鼠各主要臟器細胞質(zhì)或線(xiàn)粒體丙二醛濃度升高［8］。本研究用D半乳糖成功的造成了小鼠海馬細胞過(guò)氧化損傷（對照組和模型組比較個(gè)指標均有統計學(xué)意義），三個(gè)干預組和模型組比較各指標均有統計學(xué)意義，證實(shí)硫辛酸是一種有效的抗氧化劑，能對小鼠海馬細胞DNA損傷進(jìn)行修復，參照國內外研究，結合本次研究結果，筆者推測硫辛酸的抗氧化機制有以下幾方面：1直接發(fā)揮抗氧化作用；2再生其它抗氧化劑如維生素C，谷胱甘肽，輔酶Q10等［9－10］；3鰲合銅鐵等金屬離子［11］；4增加葡萄糖吸收利用率，增強胰島素敏感性［12］；5修飾氧化蛋白等［3］。
機體的肝臟和其它組織可合成硫辛酸，在某些疾病如糖尿病，人體內硫新酸含量比正常人少［13］，但其它病理狀態(tài)下的機體體內硫辛酸的變化情況尚不清楚，硫辛酸是否可以用于一切氧化損傷相干疾病還需要大量的科學(xué)研究來(lái)證明。
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