摘要：目的探討糖尿病小鼠肝組織氧化損傷。方法給雄性昆明種小鼠喂養高脂飲食一周后隨機分成兩組，正常對照組和糖尿病組，其中一組經(jīng)小劑量鏈脲佐菌素(STZ)注射后誘導成糖尿病小鼠，繼續喂養高脂飲食，6周后測量?jì)山M小鼠末期肝組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH），抗氧化酶（SOD，GSHPx, CAT）以及肝臟組織一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS）、肝臟臟器系數及組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察。結果試驗結束時(shí)，糖尿病組小鼠一般情況較差，體重，肝臟臟器系數與正常組比較，顯著(zhù)低于正常組（P＜001）；糖尿病組小鼠肝臟組織中MDA、GSHPX、NO顯著(zhù)高于正常組（P＜005或P＜001）, GSH，CAT，NOS顯著(zhù)低于正常組（均P＜001），SOD與正常組沒(méi)有明顯差異。光鏡下糖尿病組肝臟表現：部分細胞水腫、空泡樣變，脂肪滴增大融合。結論本研究表明糖尿病小鼠肝臟存在氧化損傷。
關(guān)鍵詞：糖尿病；氧化損傷；肝臟；小鼠

A study of liver oxidative injury in diabetic mice
JiaoShirong12  WangBo1HuangChengyu1YuShuang1YinWenya1
(1School of public health,Sichuan university,Chengdu 610041,China;
2School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039, China；

Abstract: ObjectiveTo observe the relation between liver oxidative injury of mice and diabetes mellitus. MethodsMale kunming mice were feed high fat dietary in a week and divided into 2 groups at random by weight. One of two groups was induced by small dose streptozotocin(STZ).Two groups were feed high fat dietary. After 6 weeks, we measured the activities of enzymic antioxidants (superoxide dismutase (SOD), catalase(CAT) , glutathione peroxidase (GPx) ,nitric oxide synthase (NOS),the levels of glutathione(GSH), maleic dialdehyde(MDA), nitric oxide (NO) in the liver, the liver viscera quotiety and the observingof livers histological. ResultsBody weight ,liver viscera quotiety and the activities of CAT,NOS,GSH decreased significantly(all P<0.01), the levels of MDA , GHSPX and NO increased remarkably (P<001or(P<005 ), SOD had no difference in diabetic group compared with the normal group(P>005). The liver histological damages were observed in DM group, light microscope observation showed hepatocytes swelling , punctuate necrosis and fatty droplets in hepatocytes were larger and cyncretized. Conclusions There may be oxidative injury in the liver of diabetic mice.
Keywords: Diabetes Mellitus; Oxidative Injury; Liver Tissue; mice.

肝臟是糖、脂肪代謝的主要臟器，也是攝取、儲存、合成葡萄糖和代謝的主要場(chǎng)所。持續的高血糖，不僅引起腎臟、心臟、視網(wǎng)膜和神經(jīng)病變等糖尿病慢性并發(fā)癥，也累及肝臟［1］，糖尿病性肝臟損害主要表現為肝內脂肪浸潤致脂肪肝(Fatty liver，FL)，部分可發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化。近年來(lái)氧化防御機能的異常在糖尿病并發(fā)癥的作用日益受到重視，氧化應激帶來(lái)的臟器損傷可能是糖尿病多種并發(fā)癥發(fā)病機制的共同通道［2］。關(guān)于糖尿病小鼠肝臟氧化防御機能及NO、NOS的變化，是否與肝臟組織的損傷有關(guān)系，少有報道。本試驗研究了鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)的糖尿病小鼠肝臟組織中丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH），抗氧化酶（SOD，GSHPx，CAT）、一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS）,肝臟組織的臟器系數變化及形態(tài)學(xué)改變，為探討糖尿病小鼠肝臟氧化損傷狀況，預防控制糖尿病提供依據。
1 材料與方法
11 材料
111 實(shí)驗動(dòng)物屏障級昆明小鼠體重20~25g雄鼠26只，由四川省醫科院動(dòng)物所提供（合格證號：醫動(dòng)字第24101106號）。整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中均在有IVCS（Individual Ventilated Cage System）動(dòng)物房喂養，兩組小鼠自由進(jìn)食高脂飼料和飲水，室溫20~24℃，濕度60%~70%，12h／12h明暗周期。
112 試劑與儀器鏈脲佐菌素（德國merk公司 ），MDA、NO、GSH水平、SOD、GSHPx、CAT、NOS活性測定、組織蛋白含量的測定，均采用南京建成生物研究所提供的試劑盒。血糖試紙（GLUCOCARDTMTest StripⅡ，批號77502，日本京都）、血糖儀（日本京都）、722紫外可見(jiàn)光柵分光光度計、恒溫水浴鍋、低溫低速離心機、普通低速離心機、ME100光學(xué)顯微鏡。
12 方法
121 動(dòng)物模型的建立
雄性昆明小鼠，高脂飼料（由常規飼料加10%豬油配制而成）適應性飼養1周后，按體重隨機分成2組，其中正常對照組（NC組）10只，糖尿病組(DM)16只，DM組按體重腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72小時(shí)后再加強注射1次，每次80mg／kg，NC組注射等量的檸檬酸緩沖液。加強注射后的第4天，測空腹血糖（FBG），以禁食3~5h，尾靜脈全血血糖≥111mmol／L［3］為糖尿病模型成功動(dòng)物。
122 觀(guān)察指標及測定方法
試驗過(guò)程中每周稱(chēng)體重，血糖水平用葡萄糖試紙檢測。在第6周末，稱(chēng)重，處死動(dòng)物，取肝臟稱(chēng)重。取少量肝組織，加冷生理鹽水，在冰浴條件下，制成10%的組織勻漿，低溫低速離心，取上清液，T SOD為黃嘌呤氧化酶法、CAT采用紫外分光光度法、GSHPX和GSH為二硫代二硝基苯甲酸比色法、NO和NOS為硝酸還原酶比色法、MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)縮合法測定、組織蛋白含量測定為考馬斯亮蘭法。具體測定方法按照試劑盒要求進(jìn)行。
123 組織學(xué)檢查
留取肝臟標本，甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色。
13 統計分析
實(shí)驗數據以±s表示，應用SPSS 115統計軟件進(jìn)行成組Ｔ檢驗分析，確定兩組數據有無(wú)差異。
2 實(shí)驗結果
21 動(dòng)物的一般情況
試驗過(guò)程中，正常對照組生長(cháng)情況良好，而糖尿病組動(dòng)物出現食量增加，飲水增加，尿量增多，活動(dòng)減少，精神稍委靡，被毛蓬松無(wú)光澤。
22 血糖情況、體重影響及臟器系數比較
喂養末期，糖尿病組小鼠血糖顯著(zhù)高于正常對照組（P＜001）。 兩組小鼠初始體重差異沒(méi)有統計學(xué)意義（P＞005），糖尿病組小鼠第6周實(shí)驗結束時(shí)體重顯著(zhù)低于對照組（P＜001），提示糖尿病對小鼠生長(cháng)可能有抑制作用。試驗末，處死動(dòng)物，測定肝臟臟器系數（肝臟重量／小鼠體重），糖尿病組顯著(zhù)高于對照組（P＜001），可能是由于糖尿病小鼠高血糖導致產(chǎn)生應激，肝臟代償性增大。見(jiàn)表1。

23 糖尿病小鼠氧化應激狀況
測定各氧化應激指標，糖尿病組肝臟組織中MDA，GSHPX，NO顯著(zhù)高于正常組（P＜005或P＜001）。GSH，CAT，NOS顯著(zhù)低于正常組（均P＜001）, SOD與正常組沒(méi)有差異（P＞005）。結果見(jiàn)表2。

24 肝臟組織學(xué)檢查
正常組小鼠肝組織光鏡下顯示，肝小葉結構正常，肝竇規則，肝細胞索排列整齊，見(jiàn)圖1。糖尿病小鼠部分肝細胞水腫、核固縮、胞漿空亮，核消失，空泡樣變，脂肪滴增大融合，說(shuō)明糖尿病小鼠肝細胞存在損傷，見(jiàn)圖2。

圖1正常小鼠肝組織形態(tài)20×10倍

圖2糖尿病小鼠肝組織形態(tài)20×10倍
a: 細胞水腫、核固縮；b:脂肪滴增大融合
3 討論
機體的調節機制會(huì )使體內處于相對自穩態(tài)，但是當內源性和外源性刺激使機體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量自由基（包括氧自由基，一氧化氮），過(guò)量的自由基數量超過(guò)抗氧化體系的還原能力，會(huì )使機體處于氧化應激狀態(tài)，結果導致機體的損傷。研究表明隨著(zhù)自由基增加，細胞毒性也逐漸增加［4］。同時(shí)自由基和脂肪物質(zhì)反應，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，增加脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物［5］。丙二醛（MDA）是最常見(jiàn)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA的量可以衡量脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映引起脂質(zhì)過(guò)氧化的活性氧水平（reactive oxygen species，ROS），ROS與MDA總體上均可以反映組織承受的氧化侵襲程度［6］。由本研究結果可知，糖尿病組小鼠肝臟中MDA含量顯著(zhù)增加，表明糖尿病小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化增多。
SOD主要作用在于清除超氧陰離子O2-。本實(shí)驗中SOD活性與正常組沒(méi)有差異，還稍有增加。與Ceriello等研究相符，即高濃度的葡萄糖能誘導抗氧化性酶，包括SOD的增加［7］，研究也發(fā)現生物體合成SOD常受到O2-濃度的影響，如生物體內O2-濃度高于正常水平，在O2-的誘導下，SOD的生物合成能力增強［8］。
CAT主要作用是清除組織中H2O2。實(shí)驗結束時(shí)糖尿病小鼠肝臟組織中CAT活性顯著(zhù)下降，與文獻［ 9,10］一致。這可能是由于O2-對CAT活性有抑制作用［11］。
GSHPX除了可以降低H2O2水平之外，還可以清除脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如MDA。本實(shí)驗糖尿病組GSHPX顯著(zhù)高于正常組，原因可能是CAT與GSHPX有協(xié)同清除H2O2的作用，由于CAT活性降低，GSHPX活性代償性升高，此研究結果與文獻［12-14］報道一致，但文獻［15］報道GSHPX活性顯著(zhù)降低。
除抗氧化性的酶外，GSH提供了抵抗ROS的第一道防線(xiàn)，除能清除自由基及降低H2O2水平，還能修復由自由基引起的生物學(xué)損傷［16］。當細胞GSH含量降低到一定程度時(shí)，細胞會(huì )受到不可逆損傷。因此測定GSH的含量，了解GSH動(dòng)態(tài)平衡，是反映細胞狀態(tài)的一個(gè)標志。在本研究中, 糖尿病組小鼠肝臟GSH水平下降，可能是由于持續高血糖的氧化應激產(chǎn)物ROS或由于NADPH 損耗所引起，同時(shí)GSH由于去除H2O2而被消耗減少［17］。
高血糖是導致氧自由基的產(chǎn)生重要原因之一，氧自由基增多能刺激NO的生物合成，過(guò)量的NO擴散到細胞后造成細胞損傷而成為一種細胞毒分子。NO與O2-都是自由基，兩者生成ONOO及其質(zhì)子化產(chǎn)物ONOOH，其化學(xué)性質(zhì)類(lèi)似 ·OH。ONOO可以氧化GSH成為GSSG，還可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，氧化蛋白質(zhì)及羥化作用，顯示活性氧特征［18］。動(dòng)物體內NO生物合成的唯一途徑是NO合酶（NOS）的酶促反應。作為產(chǎn)生內源性NO的催化酶，NOS具有的血紅素與酶活性有關(guān)。如果NO與NOS的血紅素結合，則會(huì )反饋抑制NOS活性［19］［20］。NO可與氧化氫酶中Fe(Ⅲ)結合為Fe(Ⅲ)NO，使過(guò)氧化氫酶活性受到抑制［21］。本實(shí)驗中糖尿病小鼠肝臟中NO含量顯著(zhù)高于正常組，而NOS和CAT活性降低，MDA顯著(zhù)增加，說(shuō)明糖尿病小鼠肝臟中可能在高糖的作用下可能產(chǎn)生了大量NO和O2-自由基，反饋抑制了NOS和CAT的活性，減少GSH含量，同時(shí)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，使MDA增加而引起肝細胞損傷。
本研究提示糖尿病小鼠肝臟內氧化、抗氧化平衡嚴重失調，氧自由基反應、氧化、過(guò)氧化及脂質(zhì)過(guò)氧化反應加劇，引起糖尿病小鼠肝臟氧化損傷，糖尿病組肝細胞形態(tài)改變也證明了這一點(diǎn)。
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