摘要：目的研究植物雌激素大豆異黃酮抑制去卵巢大鼠體重增加的作用，并從基因表達水平探討其可能的機制。方法利用高脂肪飼料喂養的去卵巢大鼠作為絕經(jīng)后肥胖模型，給予不同劑量的大豆異黃酮，觀(guān)察試驗期間體重的增加，并用RTPCR方法檢測脂肪組織中脂代謝相關(guān)基因表達。結果研究發(fā)現大豆異黃酮對高脂肪飼料喂養的去卵巢大鼠體重增加有顯著(zhù)的抑制作用；大豆異黃酮顯著(zhù)降低大鼠全身脂肪和腹部脂肪含量，并顯著(zhù)降低血清總膽固醇含量；大豆異黃酮抑制白色脂肪中FAS基因表達，對褐色脂肪中的Pparγ基因表達也有明顯的抑制作用。高劑量大豆異黃酮可激活褐色脂肪中Pparα基因表達，但低劑量的大豆異黃酮抑制Pparα基因表達。結論植物雌激素——大豆異黃酮可抑制高脂肪飼料喂養的去卵巢大鼠體重增加，并通過(guò)調節脂肪組織中脂代謝相關(guān)基因表達，抑制大鼠的血膽固醇水平增加及降低體內脂肪含量。
關(guān)鍵詞：大豆異黃酮；去卵巢大鼠；體重增加；脂代謝相關(guān)基因；RTPCR

人口老齡化是當今世界人口發(fā)展的趨勢，我國是世界上老年人口最多的國家。由于老年人群中婦女所占的比例超過(guò)男性，因此老年婦女的保健有其特殊的重要性［1］。絕經(jīng)后婦女體內雌激素水平下降，體內脂代謝發(fā)生紊亂，脂肪重新分布，并引起體重增加。而體重的增加與許多疾病如高血壓、冠心病等心腦血管疾病以及糖尿病的發(fā)生有密切關(guān)系，是這些疾病的重要危險因素。
近年來(lái)植物雌激素——大豆異黃酮（soybean isoflavone）引起研究人員的廣泛關(guān)注。已有的研究結果表明大豆異黃酮可預防絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、減輕婦女更年期綜合征的癥狀，具有降血脂、預防動(dòng)脈粥樣硬化以及預防和抑制乳腺癌、結腸癌等腫瘤生長(cháng)的作用，其生物學(xué)活性研究已成為熱點(diǎn)研究課題［2］。本研究在以往研究工作的基礎上，利用高脂肪飼料喂養的去卵巢大鼠模擬絕經(jīng)后肥胖，進(jìn)行大豆異黃酮抑制體重增加的作用效果研究，并從基因表達水平探討其可能的作用機制。
1 實(shí)驗材料與方法
11 試劑及儀器
受試樣品(大豆異黃酮)：日本Fujico公司提供的40%大豆異黃酮
mRNA提取試劑盒、cDNA試劑盒、RTPCR試劑盒：TaKaRa Bio.公司
無(wú)水乙醇、氯仿、DEPC水
RTPCR儀：Applied Biosystems Ltd ABI PRISMR 7000
血脂檢測試劑盒
12 動(dòng)物實(shí)驗
2月齡雌性SD大鼠購回后，在SPF動(dòng)物室用普通飼料喂養1周，根據體重隨機分為5組。用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50mg／kg·bw）后，手術(shù)切除雙側卵巢或假手術(shù)。各組給予高脂肪飼料，異黃酮劑量組添加不同劑量的大豆異黃酮。
實(shí)驗期間每日定量喂食，每周稱(chēng)量體重一次，記錄給食量、攝食量和撒食量，飲用水量不限。動(dòng)物室溫度20℃±2℃，12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗，通風(fēng)良好。
13 飼料配方
按照美國實(shí)驗動(dòng)物營(yíng)養飲食配方AIN93M進(jìn)行配制，但對脂肪含量進(jìn)行調整。
14 樣品的采集及檢測
實(shí)驗結束時(shí)，將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后， DEXA骨密度儀掃描測定全身及腹部脂肪含量。心臟采血，離心后分離血清用于血脂指標測定。大鼠解剖后取少量白色脂肪、褐色脂肪用液氮冷凍，然后轉移到80℃冰箱中保存，用于基因檢測。
15 脂肪組織脂代謝相關(guān)基因的檢測
將脂肪樣品用試劑盒提取mRNA，經(jīng)逆轉錄反應生成cDNA，用ABI公司的7000型RTPCR儀檢測。
檢測基因包括：
脂肪酸合成酶(FAS)
激素敏感性脂肪酶（HSL）
過(guò)氧化物酶體增生物激活受體α(PPAR α )
過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)
RTPCR擴增條件：
FAS：95℃ 10s；95℃、5s，65℃、31s；32個(gè)循環(huán)。
HSL：95℃ 10s；95℃、5s，65℃、31s；35個(gè)循環(huán)。
PPAR α：95℃ 10s；95℃、5s，67℃、31s；35個(gè)循環(huán)。
PPARγ：95℃ 10s；95℃、5s，67℃、31s；35個(gè)循環(huán)。
相同條件下測定GAPDH基因表達。
16 數據的統計學(xué)處理：
所有數據用SPSS 130統計軟件進(jìn)行分析處理。數據以均數±標準差（X±S）表示，組間差異采用方差分析進(jìn)行處理。
2 實(shí)驗結果
21 實(shí)驗期間大鼠體重的變化
實(shí)驗過(guò)程中每周稱(chēng)量大鼠體重一次，結果見(jiàn)圖1（表格中的Sham, Ovx, LSI, MSI, HSI分別為假手術(shù)對照組、去卵巢對照組、去卵巢+低劑量大豆異黃酮組、去卵巢+中劑量大豆異黃酮組和去卵巢+高劑量大豆異黃酮組）。

Fig 1The rat's body weights during experiment

由圖1可以看出，實(shí)驗前，各組大鼠的平均體重沒(méi)有顯著(zhù)性差異。從第二周開(kāi)始，Ovx組大鼠體重顯著(zhù)增加（P＜005），此后，這一差異保持到實(shí)驗結束。大豆異黃酮各組大鼠體重與Sham組相近，說(shuō)明大豆異黃酮對去卵巢誘導的大鼠體重增加有顯著(zhù)的抑制作用，但標準差較大，顯示大鼠對大豆異黃酮弱雌激素作用的敏感性不同。
22 大豆異黃酮對大鼠脂肪含量及血脂指標的影響
221 全身脂肪和腹部脂肪百分含量
實(shí)驗結束后，利用雙能X射線(xiàn)骨密度測定儀對大鼠進(jìn)行全身掃描，測定體脂肪及第二至第七腰椎對應的腹部脂肪含量，結果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，給予大豆異黃酮各組大鼠的全身脂肪和第二至第七腰椎對應的腹部脂肪含量百分比顯著(zhù)低于Ovx組，表明大豆異黃酮對去卵巢和高脂飼料誘導的體內脂肪含量、尤其是腹部脂肪含量增加具有顯著(zhù)的抑制作用。
222 血脂指標
實(shí)驗結束時(shí)，分離血清，測定血脂指標TC、TG、HDL，結果見(jiàn)表2。

根據表2中的數據可知，與去卵巢對照組相比，給予大豆異黃酮后，血清中總膽固醇(TC)含量顯著(zhù)降低(P＜001)；各組TG、HDL沒(méi)有顯著(zhù)變化。
23 大豆異黃酮對脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達的影響用RTPCR方法分別檢測白色脂肪和褐色脂肪中脂肪酸合成酶（FAS)、激素敏感性脂肪酶（HSL）、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體α和 γ（PPARα和PPARγ)的基因表達，結果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

Fig 2Effect of isoflavone treatments on FAS mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO)

從圖2可以看出，大鼠去除卵巢后，脂肪組織中FAS基因表達下降，大豆異黃酮對白色脂肪FAS的基因表達有一定抑制作用，但本研究沒(méi)有看到劑量效應關(guān)系。
圖3顯示，大鼠去卵巢后，白色脂肪組織HSL表達增加，而褐色脂肪中HSL表達下降。與Ovx組相比，高劑量大豆異黃酮對HSL基因表達有一定的抑制作用。
圖4的結果表明，與Ovx對照組相比，不同劑量大豆異黃酮對PPARα, PPARγ的表達影響不同。低、中劑量的大豆異黃酮對Pparα和PPARγ基因表達有一定的抑制作用。高劑量的大豆異黃酮對褐色脂肪中的Pparα基因表達有顯著(zhù)的促進(jìn)作用，但抑制PPARγ基因的表達。

Fig 3Effect of isoflavone treatments on HSL mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO)

Fig 4Effect of isoflavone treatments on PPARα, PPARγ mRNA expression in white adipose tissue(A), brown adipose tissue(B) Animal groups were Sham operated control (Sham), ovariectomized control (Ovx), ovariectomized and treated with different isoflavone (LISO, MISO and HISO).
3 討論
肥胖主要表現為機體脂肪組織的量過(guò)多或脂肪組織與其它軟組織的比例過(guò)高。體重是衡量肥胖程度的重要指標之一，因為肥胖常表現為體重超過(guò)標準體重。本研究的實(shí)驗結果發(fā)現，高脂肪飼料喂養的去卵巢大鼠，從第二周開(kāi)始，Ovx組體重顯著(zhù)增加（P＜005），此后，這一差異保持到實(shí)驗結束，表明肥胖模型誘導成功。大豆異黃酮各組大鼠體重與Sham組相近，說(shuō)明大豆異黃酮對去卵巢和高脂飼料誘導的大鼠體重增加有顯著(zhù)的抑制作用，但標準差較大，顯示大鼠對大豆異黃酮弱雌激素作用的敏感性不同。利用雙能X射線(xiàn)骨密度儀對大鼠進(jìn)行全身脂肪的掃描，發(fā)現大豆異黃酮具有顯著(zhù)降低大鼠全身脂肪的作用，尤其是顯著(zhù)降低第二至第七腰椎對應的腹部脂肪含量。血脂指標檢測結果表明大豆異黃酮對血清總膽固醇含量有顯著(zhù)抑制作用。
機體內有兩種形式的脂肪組織——白色脂肪組織和褐色脂肪組織。白色脂肪組織存在于整個(gè)機體，主要作為能量?jì)Υ娴膱?chǎng)所。褐色脂肪組織主要參與熱調節，位于機體的有限的部位。動(dòng)物和人體實(shí)驗均證明雌激素在白色脂肪組織調節中起著(zhù)重要的作用。嚙齒動(dòng)物切除卵巢后，白色脂肪組織增加，雌激素治療后白色脂肪組織減少。絕經(jīng)后婦女體內白色脂肪組織增加，雌激素替代治療后則減少。因此，本研究對大鼠肝臟、白色脂肪和褐色脂肪中一些脂代謝相關(guān)基因進(jìn)行檢測。
脂肪酸合成酶在動(dòng)物體脂生成和沉積中發(fā)揮重要作用，動(dòng)物脂肪組織中脂肪酸合成酶的活性與機體脂肪量呈顯著(zhù)正相關(guān)。有研究表明，FAS基因表達受抑可導致小鼠體脂肪含量迅速降低，說(shuō)明FAS在調節體內能量平衡中發(fā)揮重要作用［3］。本研究結果顯示，在白色脂肪和褐色脂肪中，Ovx對照組與Sham組相比，FAS基因的表達并沒(méi)有因肥胖而增加，反而下降。研究發(fā)現，攝食和胰島素可刺激FAS基因表達；饑餓、甲狀腺素、cAMP和多不飽和脂肪酸可抑制其表達。因此，我們分析其原因可能是由于控制了Ovx對照組大鼠的攝食，造成大鼠長(cháng)期處于饑餓狀態(tài)，引起FAS基因表達的反饋性下降。給予大豆異黃酮后，對去卵巢大鼠白色脂肪中脂肪酸合成酶（FAS）的基因表達有顯著(zhù)抑制作用，這種作用不是由攝食造成的。
肥胖與體內脂肪的堆積密切相關(guān)，而脂肪堆積是一個(gè)復雜的過(guò)程，受飲食、內分泌、神經(jīng)等多方面的調控。機體內脂肪代謝處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，體內脂肪的積累受甘油三酯合成和分解代謝速度的雙重調節。動(dòng)物將脂肪酸以甘油三酯的形式貯存在脂肪組織內。一旦機體需要時(shí)，脂肪酶即可將甘油三酯水解為游離脂肪酸和甘油并釋放入血以供其他組織氧化利用，這一過(guò)程稱(chēng)為脂肪動(dòng)員，調節這一過(guò)程的關(guān)鍵酶為激素敏感性脂肪酶。本研究用RTPCR測定了大鼠肝臟中激素敏感脂肪酶mRNA的表達，結果發(fā)現，大鼠去卵巢后，白色脂肪組織HSL表達增加，而褐色脂肪中HSL表達下降。與Ovx組相比，高劑量大豆異黃酮對HSL基因表達有一定的抑制作用。
過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPARs)屬于核內激素受體超家族，有α, β, γ三種亞型。PPAR對脂質(zhì)代謝、糖類(lèi)代謝、細胞生長(cháng)分化及凋亡有重要影響。PPARα主要與肝內脂類(lèi)代謝，可誘導肝臟脂代謝相關(guān)基因的轉錄，增強肝臟脂肪酸β氧化相關(guān)酶的活性，減少TG合成和向外輸出，引起外周組織向肝臟的脂肪酸流量增加，降低血脂。PPARγ主要與脂肪平衡、誘導脂肪細胞分化及胰島素有關(guān),是誘導脂肪細胞分化的特異性轉錄因子。PPARγ的激活有助于脂肪細胞的分化，并促進(jìn)非脂肪細胞分化成脂肪細胞。PPARγ通過(guò)調節相關(guān)基因的表達，在脂肪形成、糖、脂代謝、能量代謝，以及在免疫系統中發(fā)揮重要的調節作用。研究發(fā)現，大豆異黃酮可激活大鼠白色脂肪組織PPARα和PPARγ基因表達，促進(jìn)脂肪分解［4］；流行病學(xué)調查顯示絕經(jīng)后婦女高膳食異黃酮的攝入與其較低的BMI相關(guān)［5］。從本研究的實(shí)驗結果可以看出，低、中劑量的大豆異黃酮對脂肪組織Pparα和PPARγ基因表達有一定的抑制作用。高劑量的大豆異黃酮對褐色脂肪中的Pparα基因表達有顯著(zhù)的促進(jìn)作用，但抑制PPARγ基因的表達。
現代醫學(xué)研究證明，婦女進(jìn)入更年期后，由于卵巢功能逐步衰退、雌激素分泌降低，引起更年期綜合征的發(fā)生，以及血脂代謝和糖代謝紊亂、骨量丟失加快等，導致絕經(jīng)婦女體內體內脂肪分布發(fā)生明顯改變。絕經(jīng)婦女患高血脂、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病以及糖尿病、骨質(zhì)疏松癥的危險性提高。而這一變化過(guò)程是一個(gè)緩慢和循序漸進(jìn)的過(guò)程，很多人沒(méi)有意識到它的發(fā)生，也沒(méi)有多加注意和預防。一旦出現疾病癥狀，再進(jìn)行預防已為時(shí)過(guò)晚，因此有必要采取措施延緩這一過(guò)程的發(fā)生。近年來(lái)，動(dòng)物和人體的一些新的研究結果發(fā)現攝入或補充富含植物雌激素的食品對預防糖尿病和肥胖的發(fā)生具有一定的作用，因此大豆異黃酮降脂、預防肥胖和糖尿病的作用研究已成為植物雌激素研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)［69］。
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