摘要：本文利用獨自建立的三基因突變 (apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db，ALO)小鼠模型，探討大蒜素對其血脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）發(fā)展的影響。結果顯示，高脂／高膽固醇／高糖喂養的小鼠，較普通飲食同齡小鼠血脂TC，TG水平明顯增高。大蒜素處理組不同程度地抑制了血脂增高的趨勢，對脂肪肝以及動(dòng)脈粥樣硬化病變均有一定的抑制作用。今后有待于進(jìn)一步系統深入研究。
另外，我們此次采用90％乙醇溶液為浸提劑的大蒜素萃取方法效果最好。
關(guān)鍵詞： 三基因突變(apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db, ALO)小鼠；動(dòng)脈粥樣硬化(AS)；大蒜素；高血脂

Atherosclerosis is a complex multifactorial disease. At present study, apoE-／-／LDLR-／-／Leprdb／db ，a treplegene mutant (ALO) mouse was established for the first time, and has been used for study the effects of allicin on hyperlipidemia as well as atherogenesis.
1The level of TC and LDLC are decreased in ALO mice which received allicin compared to those mice received distilled water. But the level of TG and HDLC are not changed significantly in allicin trated groups.
2The body weight have no visible Changes compared to those mice received distilled water.
3When feeded with normal diet, the liver apomorphosis is obviously changed compared to those mice received distilled water. Feeded with high sucrose ／fat／cholesterol diet, however, the efect of allicin is shown more affective, and the fat drops in liver cell is became more small and less than those mice given by distilled water as placebo.
4The morphology change of atherosclerosis in allicin groups shown slightly inhibited compared with that of placebo group.
5These results indicated that triple gene mutation is strong contributed to sever hyperlipidemia and allicin has a role that inhibited the progress in development of dyslipidemia and atherogenesis in our unique ALO mice model.

多數疾病與基因變異或基因多態(tài)性有關(guān)，而相當一部分疾病的發(fā)生發(fā)展均涉及到兩個(gè)以上基因的結構或表達調控的改變。動(dòng)脈粥樣硬化癥（athrosclerosis, AS）是嚴重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)的多基因疾病。脂質(zhì)代謝異常、肥胖、糖尿病等諸多因素均可導致AS。人以及動(dòng)物研究表明，血脂代謝異常導致的動(dòng)脈內膜損傷、脂質(zhì)沉積是AS的重要始動(dòng)原因。血漿總膽固醇（TC）和甘油三脂（TG）增高等血脂代謝紊亂以及脂質(zhì)氧化是引起動(dòng)脈內脈損傷的重要原因之一(1-3)。
肥胖作為心腦血管疾病危險因子，常與其它致病因素并存，共同參與多種相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。瘦素受體(leptin receptor，LR)介導瘦素參與糖、脂肪等能量代謝及體脂調節。LR編碼基因（db）突變（Leprdb／db）小鼠表現為皮下及內臟周?chē)具^(guò)渡沉積，個(gè)體高度肥胖并伴有血脂、血糖代謝失衡(4,5)，說(shuō)明瘦素及其受體功能異常與肥胖以及相關(guān)病變有關(guān)。目前中國有2億人超重、7000萬(wàn)人肥胖，高血壓和高血脂的人數都超過(guò)16億，冠心病、中風(fēng)等心血管疾病患者呈急速增長(cháng)趨勢。
數千年來(lái)大蒜在中國等亞洲國家，一直是一種藥食兩用的食品。二十世紀70年代以來(lái)國際上越來(lái)越重視對大蒜藥用價(jià)值的研究和應用，現代醫學(xué)研究也說(shuō)明大蒜和天然大蒜制劑有非常好的防病治病功效。其強大的藥理作用價(jià)值已備受?chē)H醫學(xué)界和消費者的青睞，成為歐美等國用于抗菌、提高免疫力、調節血脂和抗腫瘤的首選天然治療藥物。然而，應用脂代謝關(guān)鍵基因突變小鼠模型，開(kāi)展大蒜素對其血脂代謝紊亂影響以及抗AS的研究不多，為此在前期工作的基礎上，我們利用三基因突變小鼠（ALO），討論了在大蒜素對其降血脂以及抗AS的作用特點(diǎn)。
材料與方法
1小鼠：待小鼠出生后第4周停止母乳喂養，小鼠分6組，在不同飲食喂養條件（普通飼料含4％動(dòng)物脂肪和0075％膽固醇；高脂高膽固醇飼料含10%動(dòng)物脂肪和125%）的同時(shí)，分別添加安慰劑和大蒜素溶液灌胃，所有小鼠于SPF級動(dòng)物房飼養、繁殖，恒溫、恒濕、12小時(shí)日暗循環(huán)環(huán)境，飲水和飼料均令其自由攝取。

2給藥方式：從第4周至第15周齡連續12周的喂養過(guò)程中， 1天／2次，每天早晚9點(diǎn)各給藥一次，間隔12小時(shí)；每次每只小鼠給藥量為10mg／kg大蒜素抽提液。
3血生化指標檢測：分別采集3、5、7、11和15周齡小鼠（n=6）尾靜脈血01ml，分離血清，采用CODPAP、GPOPAP法和免疫抑制酶試劑直接法［,］，測定TC、TG、HDLC和LDLC濃度。所有數據以x±s表示，應用SPSS110統計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗結果采用獨立樣本的ttest檢驗，P＜005為統計學(xué)有顯著(zhù)性差異，P＜001為統計學(xué)有極顯著(zhù)差異。
4肝臟以及主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀(guān)察：待小鼠15周齡時(shí)，解剖小鼠（n=6），分別制備肝臟和主動(dòng)脈冰凍切片（5μm），采用油紅O和HE染色，光學(xué)顯微鏡下拍照紀錄。
結果
1 血脂、血糖水平變化（圖1，圖2，圖3，圖4）

圖1小鼠不同年齡時(shí)期血清TC水平

圖2小鼠不同年齡時(shí)期血清 TG水平

圖3不同年齡時(shí)期血清HDLC水平

圖4不同年齡時(shí)期血清LDLC水平
2 肝臟形態(tài)學(xué)檢測
普通飲食喂養的小鼠，5w齡時(shí)肝臟切片HE染色后也不見(jiàn)明顯變化（圖5A），隨年齡增長(cháng)，至15w齡時(shí)，肝細胞表現出明顯的脂肪變性，胞漿內出現大小不等的脂滴。高脂高膽固醇喂養的小鼠，在5w齡時(shí)，肝臟就表現出一定程度的脂肪變性，肝細胞質(zhì)內出現大小不等的脂肪滴（圖5C）。喂養12w時(shí)，大小不等的脂滴融合成較大的脂滴，充滿(mǎn)于肝細胞質(zhì)內，使肝細胞體積明顯增大（圖5D）。增加高糖飲水的小鼠肝臟脂肪變形程度較同周齡單純高脂高膽固醇飼料喂養的小鼠相比更為嚴重（圖5E、F）；大蒜素給藥處理的小鼠在普通飲食條件下與蒸餾水安慰劑處理的小鼠相比肝臟脂肪變性程度略有減輕，但不明顯（圖6A-B）。而高脂高膽固醇飲食組和高糖高脂高膽固醇飲食組的小鼠肝臟脂肪變性有明顯的減緩（圖6CF）。

圖5 0.9%生理鹽水安慰劑對照組小鼠
的肝臟冰凍切片HE紫色
A：5周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
B：15周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
C：5周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
D：15周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
E：5周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×600）
F：15周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×60）

圖6大蒜素給藥組小鼠的
肝臟冰凍切片HE染色
A：5周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
B：15周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
C：5周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
D：15周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
E：5周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×600）
F：15周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×60）

肝臟油紅O染色結果，證實(shí)不同年齡段小鼠肝細胞的脂肪病變程度，與HE染色結果吻合（圖7）。大蒜素給藥組肝組織脂肪病變相對較輕（圖8）。

圖7 0.9%生理鼻水安慰對照組
小鼠的肝臟冰凍切片油紅染色
A：5周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
B：15周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
C：5周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
D：15周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
E：5周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×600）
F：15周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×60）

圖8大蒜素給藥組小鼠的
肝臟冰凍切片油紅染色
A：5周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
B：15周齡ALO小鼠，普通飲食（×600）
C：5周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
D：15周齡ALO小鼠，高脂高膽固鋅飼料（×600）
E：5周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×600）
F：15周齡ALO小鼠，高糖高脂高膽固鋅飲食（×60）

3 主動(dòng)脈形態(tài)
所有實(shí)驗組小鼠主動(dòng)脈均有不同程度的AS早期病理變化（圖9）。根部主動(dòng)脈內膜有泡沫狀細胞堆積病灶，內膜增厚、平滑肌細胞的游走和增值，結締組織增生以及膽固醇結晶核等。其病變的程度依次為高脂高膽固醇+蔗糖組＜高脂高膽固醇+普通飲水＞高脂高膽固醇+大蒜組＞普通飲食+大蒜組。

圖9高脂+高糖喂養的15周齡ALO小鼠主動(dòng)脈（右圖），有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病灶，大蒜素處理的高脂喂養組，病變較前者輕。
討論
5w齡到15w齡整個(gè)喂養階段內，同一時(shí)間內高脂高膽固醇飲食喂養的小鼠的TC水平均顯著(zhù)高于普通飲食喂養的小鼠，而加以高糖飲水配同高脂高膽固醇飼料喂養的小鼠又要比單純高脂高膽固醇飼料喂養的小鼠。各實(shí)驗組內小鼠TC水平從3w齡到7w齡內先是逐漸增加，后趨于平穩。實(shí)驗中輔以大蒜素給藥處理的小鼠，其TC水平比同飲食小組相對低，并隨年齡增長(cháng)，與同樣飲食條件空白對照組小鼠之間的TC水平差值幅度有所增大。
HDLC、LDLC水平的變化情況與TC相似，小鼠在普通飲食、高脂高膽固醇、高糖高脂高膽固醇飲食3個(gè)喂養條件下依次增加，并都隨著(zhù)小鼠年齡的增長(cháng)，有個(gè)逐漸增加的過(guò)程，至11w齡大小左右時(shí)其HDLC、LDLC水平開(kāi)始趨于穩定。輔以大蒜素給藥處理后，同一時(shí)期內，相同飲食條件的小鼠的LDLC水平有一定程度的降低，但比較TC水平變化其下降趨勢要小很多。而HDLC水平在大蒜素給藥處理后，同樣飲食條件各組小鼠之間比較沒(méi)有發(fā)生大的變化。
實(shí)驗各組小鼠的TG水平在普通飲食、高脂高膽固醇、高糖高脂高膽固醇飲食3個(gè)喂養條件下依次增加，并隨著(zhù)小鼠周齡增長(cháng)而逐漸增加。同一時(shí)期內，相同飲食條件的兩組對比組的小鼠TG水平在大蒜素給藥處理后之間比較基本沒(méi)有變化。
普通飲食喂養的小鼠，5w齡時(shí)肝臟無(wú)明顯變化，但隨年齡增長(cháng)，至15w齡時(shí)，該小鼠表現出明顯的肝臟脂肪變性。高脂高膽固醇飲食喂養的小鼠，5w齡時(shí)，肝細胞質(zhì)內即出現散在的小脂肪滴。高脂高膽固醇飲食喂養時(shí)間越長(cháng)，小鼠肝臟脂肪變性程度越重。增加高糖飲水的小鼠肝臟脂肪變形程度較同周齡單純高脂高膽固醇飼料喂養的小鼠相比更為嚴重；大蒜素給藥處理的小鼠在普通飲食條件下與蒸餾水安慰劑處理的小鼠相比肝臟脂肪變性程度略有減輕，但并不明顯。而高脂高膽固醇飲食組和高糖高脂高膽固醇飲食組的小鼠則由于大蒜素的藥理作用使得肝臟脂肪變性有明顯的減緩。
apoE基因的缺失導致對富含膽固醇的脂蛋白清除障礙，使TC、 LDL和 VLDL增高、泡沫細胞形成并堆積于血管壁內。LDLR基因缺乏的人或小鼠由于富含apoB100的LDL的聚集，TC中度增高，AS也較緩慢且輕微。而當apoE依賴(lài)的LDLR途徑和非LDLR途徑受阻時(shí)會(huì )導致小鼠在幼齡時(shí)即出現乳糜微粒、LDL和IDL增高，血脂代謝異常和AS的病變程度更為嚴重。瘦素受體介導瘦素參與體內脂肪和糖等能量及脂蛋白的代謝與調節，其基因缺失的小鼠幼齡開(kāi)始即出現病理性肥胖、胰島素抵抗，并伴有血糖、TG及TC的輕度升高，但未出現明顯的AS性病變（潘論文）。提示該小鼠體內apoE和LDLR等發(fā)揮著(zhù)血脂代謝的主要作用，而單獨存在的瘦素／瘦素受體相關(guān)代謝途徑在血脂代謝中不占主要地位。
高血糖能產(chǎn)生超氧化應激，增加體內氧自由基和糖基化終產(chǎn)物的生成，導致內皮受損、LDL的氧化和糖基化以及高膽固醇血癥的發(fā)生；修飾的LDL可促進(jìn)單核細胞遷入動(dòng)脈內膜并轉變成泡沫細胞。高血糖還可促進(jìn)動(dòng)脈平滑肌細胞的增生和聚集，參與了ALO小鼠血脂紊亂及早期A(yíng)S發(fā)生發(fā)展，加速AS斑塊的形成。
因此，脂代謝相關(guān)的apoE、LDLR、db基因聯(lián)合突變導致了ALO小鼠普通飲食組從3w齡開(kāi)始即出現血脂、血糖的紊亂及血漿脂蛋白水平的異常，且發(fā)生時(shí)間提前，說(shuō)明apoE和LDLR雙基因缺失，聯(lián)合db基因突變加重了由血脂代謝轉運障礙導致的血脂紊亂和血漿脂蛋白異常，引發(fā)了血糖代謝失衡，從而加速了AS性病變的發(fā)生發(fā)展。高脂高膽固醇飲食的誘導作用加速了這一病理過(guò)程。因此，三基因突變對血脂紊亂和AS的影響不僅是單個(gè)基因突變效應的加和，多基因間的相互影響和作用在A(yíng)LO小鼠血脂紊亂及AS性病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。
本實(shí)驗表明，脂代謝相關(guān)三基因突變的ALO小鼠幼齡時(shí)即表現出明顯的高脂血癥和早期A(yíng)S性病變，且隨年齡的增長(cháng)，血脂紊亂和AS病變程度加劇，還伴隨明顯的肝臟脂肪變性。高脂高膽固醇飲食加劇了肝臟的這一病變，反映了飲食性因素對AS發(fā)生發(fā)展的影響。
大蒜含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、維生素及礦物質(zhì)等。大 蒜 素(Allicin) ，即二烯丙基硫代亞磺酸醋，是大蒜油中的主要成分。大蒜素對血管的作用是通過(guò)降低血漿總膽固醇及肝臟cAMP水平等作用實(shí)現的。大蒜素由于具有較強的還原性而具有抗氧化能力，能與活潑自由基反應，形成穩定的新自由基，從而切斷引起油脂自動(dòng)氧化的自由基鏈式反應:大蒜提取物含還原態(tài)硫，有較強的還原性，能將過(guò)氧化物及氧還原掉，從而發(fā)揮抗氧化作用。
大蒜素對高膽固醇血癥的保護機制是在增加脂質(zhì)分解和抑制膽固醇及脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶系統中發(fā)揮作用的。高質(zhì)血癥可引起血小板聚集性升高、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病、血栓等的形成和發(fā)展。研究表明，大蒜素可降低機體血漿內皮素(ET)的水平，這對預防和緩解冠脈痙攣、減小外周血管張力。同時(shí)，大蒜素對血漿一氧化氮(NO)濃度有升高作用。另外，大蒜素能對乙醇所致的各種抗氧化酶的變化有逆轉效應，對乙醇性肝損傷的保護作用與其增強肝臟抗氧化作用有關(guān)。本文在前期實(shí)驗的基礎上增加了高糖飲水及禁食過(guò)程對小鼠脂肪堆積及血脂異常，并由此引發(fā)動(dòng)脈病變的影響，并初步探討了大蒜提取物之一的大蒜素在緩解和治療AS病變中所發(fā)揮的作用。本實(shí)驗所提取的大蒜素是通過(guò)乙醇溶液作為有機溶劑從破碎的大蒜組織中萃取得到的，是大蒜提取物中非常重要的生物活性組分之一，純度達到90%以上。本實(shí)驗結果顯示大蒜素對于因高糖高脂高膽固醇飲食不當引起的血脂異常及動(dòng)脈粥樣硬化均有一定的療效，表現在對血脂TC、LDLC兩項血液生化指標有一定程度的降低，分別達到6％、45％左右，同時(shí)動(dòng)脈斑塊也有一定程度的抑制。本工作的后續實(shí)驗將深入開(kāi)展脂代謝相關(guān)功能蛋白的蛋白組學(xué)分析研究，大蒜素組分的進(jìn)一步分離純化及其藥代藥動(dòng)研究以及降血脂和抗AS的機理研究，為今后相關(guān)疾病的防治藥物的開(kāi)發(fā)打下堅實(shí)的基礎。
參考文獻
［1］ Ross. R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993; 362: 801-809.
［2］ Zhang SH, Reddick RL, Piedrahita JA et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science, 1992; 258: 468-471.
［3］ Ishibashi S, Herz J, Maeda N, et al. The tworeceptor model of lipoprotein clearance: tests of the hypothesis in “knockout ” mice lacking the low density lipoprotein receptor, apolipoprotein E, or both proteins. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1994; 91: 4431-4435.
［4］ Tartaglia LA, The leptin receptor. J Biol Chem., 1997; 272: 6093-6096.
［5］ Chua SC Jr., Chung WK, WuPeng XS, et al. Phenotypes of mouse diabetes and rat fatty due to mutations in the OB (leptin) receptor. Science, 1996; 271: 994-996.