摘要：目的觀(guān)察抗性淀粉（RS）對大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因表達的影響，探討RS干預膽固醇代謝的作用機制。方法將18只大鼠隨機分為三組，分別飼食正常化學(xué)純合飼料（對照組）、含15%RS純合飼料（低RS組）和含30%RS純合飼料（高RS組）6周。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測各組大鼠肝組織中膽固醇7a羥化酶（CYP7A1）、肝清除細胞B1受體（SRB1）、肝低密度脂蛋白受體（LDLR）mRNA表達水平。并檢測各組大鼠血膽固醇、盲腸內容物短鏈脂肪酸（SCFA）含量。結果大鼠肝組織CYP7A1mRNA、SRB1mRNA、LDLR mRNA表達水平及盲腸內SCFA含量，高RS組與對照組相比顯著(zhù)增加（P＜005）。血清膽固醇水平，RS干預組顯著(zhù)低于對照組（P＜005）。結論RS通過(guò)增強肝組織膽固醇代謝相關(guān)基因表達水平，增加盲腸內SCFA含量，發(fā)揮降低血膽固醇的作用。
關(guān)鍵詞：抗性淀粉；基因；干預；膽固醇代謝

Study on effect of resistant starch on gene expression
 of genes associated with cholesterol metabolism in rat liver.Zhangwenqing1Zhangyueming2
1Shanxi Medical University, Taiyuan ,0300012Xinjiang Medical University,Wulumuqi, 830054

Abstract:Objectivewe examined the effects of RS on serum cholesterol and on gene expression of genes associated with cholesterol metabolism in rat liver in order to understand the mechanism on reducing the serum cholesterol level. MethodsEighteen rats were randomly assigned to three groups, six rats each group. They were fed with chemical purified normal diet (control group), lower RS (15%HiMaize 1043) diet and high RS (30%HiMaize 1043) diet，respectively. Six weeks later, sercum cholesterol and short chain fatty acid (SCFA) concentration in the cecum were measured. Likewise, hepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, and SRB1mRNA levels were measured by Realtime PCR. ResultsHepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, SRB1mRNA levels and cecal acetate, propionate and nbutyrate concentrations in the high RS group were significantly higher than in the control group(P＜005＝. Sercum cholesterol in intervention group were significantly lower than in the control group(P＜005＝. ConculsionRS reduces serum cholesterol level by increasing hepatic cholesterol 7ahydroxylase, LDL receptor, and SRB1mRNA levels, and by increasing cecal SCFAs contents.
Keywords:resistant starch; gene; intervention; cholesterol metabolism.

抗性淀粉（resistant starch，RS）為“健康人小腸中不吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物”，具有抵抗淀粉酶消化的特性，在結腸微生物的作用下發(fā)酵，產(chǎn)生有代謝活性的短鏈脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸）。大量研究表明，短鏈脂肪酸可被結腸上皮細胞利用和通過(guò)肝門(mén)靜脈進(jìn)入血循環(huán)，影響肝臟中的膽固醇代謝，降低正常和高膽固醇大鼠的血膽固醇水平［1, 2］。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗和臨床試驗也發(fā)現：Himaize 1043抗性淀粉可降低糖尿病模型大鼠及2型糖尿病患者的血膽固醇水平［3］。本研究觀(guān)察Himaize 1043抗性淀粉對正常大鼠血清膽固醇及盲腸內容物短鏈脂肪酸（SCFA）含量的影響，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測大鼠肝組織中膽固醇7a羥化酶(CYP7A1)、肝清除細胞B1受體(SRB1)、肝低密度脂蛋白受體(LDLR)mRNA表達水平，初步探討抗性淀粉降血膽固醇的分子生物學(xué)機制，為今后深入研究這一食物功效成分奠定基礎。
1 材料與方法
11 實(shí)驗動(dòng)物與飼養
111 動(dòng)物來(lái)源及飼料：Wister大鼠（雄性），體重180～200g，清潔級，由新疆醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供。采用由中國醫學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物研究所配制的化學(xué)純合飼料，分為基礎飼料、低Himaize 1043飼料、高Himaize 1043飼料。Himaize 1043由國民淀粉上海有限公司提供。
112 分組與飼養：根據體重將18只大鼠隨機分為3組（對照組、高RS組、低RS組），每組6只。飼養于新疆醫科大學(xué)醫學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心，溫度20±1℃，人工晝夜（每天照明12小時(shí)），單籠喂養，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗開(kāi)始三組大鼠體重、血脂濃度無(wú)組間差別。實(shí)驗期共6周，每三周測一次體重，每天記錄進(jìn)食量。
12 測量指標與方法
121 血膽固醇
于實(shí)驗0周、3周、6周大鼠尾靜脈采空腹血1ml，置于無(wú)抗凝劑的EP管內，室溫靜置2h離心，吸取血清50ul酶法檢測總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）。計算TC／HDLC。
122 盲腸內容物重量、pH值及SCFA含量的測定
實(shí)驗末腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，剖開(kāi)腹腔取出盲腸，稱(chēng)重后，取出盲腸內容物，盲腸壁用蒸餾水擦凈、濾紙吸干后，再次稱(chēng)重，并計算腸內容物重量。稱(chēng)取盲腸內容物05g于5ml離心管，加蒸餾水1∶10稀釋?zhuān)尤?～4粒玻璃珠勻漿，離心后取上清液于精密pH計測定。另取盲腸內容物03g加蒸餾水2ml，離心后取上清液15ml，加入1∶5的磷酸05ml，離心后取上清液，經(jīng)045um濾膜抽濾后，取10ul注入氣相色譜儀，以2ethylbutyric acid作為內參標準，測定SCFA含量。
123 糞便重量及pH值
實(shí)驗前及實(shí)驗末，各收集大鼠三日糞便，自然干燥后稱(chēng)重。取新鮮糞便03mg，加蒸餾水1∶10稀釋?zhuān)瑒驖{后離心取上清液于精密pH計測定。
124 肝組織總mRNA抽提、cDNA合成、熒光實(shí)時(shí)定量PCR
依Trizol試劑盒（Gibco公司）說(shuō)明提取肝組織總RNA，M－MLV逆轉錄酶盒(Promega公司)合成cDNA。PCR所用引物見(jiàn)表1，由上海康成生物技術(shù)公司合成。擴增產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳（含05ug／ml的溴化已錠），凝膠成像系統（Vilber Louramt, France）拍照。在PCR反應體系中加入熒光染料Sybergreen，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析［4, 5］。針對待測基因（CYP7A1mRNA、LDLR mRNA、SRB1 mRNA）和管家基因(GAPDH)，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應，根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線(xiàn)，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成(RotorGene 3000 Realtime PCR儀)。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

13 統計分析
應用SPSS 110 for window軟件包對實(shí)驗數據進(jìn)行統計分析，采用單因素方差分析，數據用X±S表示，α＝005為檢驗水準。
2 結果
21 動(dòng)物的一般情況（見(jiàn)表1）
實(shí)驗期間，三組大鼠飲食活動(dòng)正常。實(shí)驗末低RS組、高RS組與對照組相比，大鼠體重增值、攝食量無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005）。肝臟重量、盲腸重量也無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005）。
22 RS對大鼠排便量及pH值的影響（見(jiàn)表2）
實(shí)驗末收集大鼠三日排出的糞便，自然干燥后稱(chēng)重，發(fā)現糞便重量隨RS攝入量的增加而增加，糞便pH值隨RS攝入量的增加而降低，高RS組與對照組相比有顯著(zhù)差異（P＜005）。低RS組與高RS組之間無(wú)差異。

23 RS對大鼠盲腸內容物重量、pH值、短鏈脂肪酸含量的影響（見(jiàn)表3）
如表3所示，三組大鼠在實(shí)驗末盲腸內容物重量、pH值、各SCFA含量及總SCFA含量產(chǎn)生顯著(zhù)差異（P＜005）。RS干預組（低RS組和高RS組）與對照組相比，盲腸內容物重量、SCFA含量有顯著(zhù)增加，pH值顯著(zhù)降低（P＜005）。低RS組與高RS組相比，檢測指標未產(chǎn)生差異。

4 RS對大鼠血脂的影響（見(jiàn)表4）
從表4數據可見(jiàn)，三組大鼠實(shí)驗前，血脂各項檢測指標無(wú)差異（P＞005）。實(shí)驗3周末、6周末時(shí)，RS干預組TC、HDLC、LDLC及TC／HDLC比值較對照組有顯著(zhù)降低（P＜005），RS干預組之間TC、HDLC、LDLC也產(chǎn)生顯著(zhù)差異（P＜005）。即隨著(zhù)RS攝入量增加血膽固醇水平隨之降低，并有劑量反應關(guān)系。

25 RS對大鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因
表達水平的影響（見(jiàn)表5、圖2）
在進(jìn)行Realtime PCR反應中，為了標準化反應體系的RNA或DNA質(zhì)量，同時(shí)擴增了一內源控制物，即管家基因3磷酸甘油醛（GAPDH）。每個(gè)待測基因濃度除以管家基因的濃度，即為此基因校正后的相對含量，結果見(jiàn)表5。從表中數據可見(jiàn)，大鼠肝臟清除細胞B1受體(SRB1)、LDL受體(LDLR)、7α膽固醇脫氫酶(CYP7A1) mRNA表達水平，高RS組與對照組相比產(chǎn)生顯著(zhù)差異（P＜005），高RS組與低RS組之間未產(chǎn)生差異。

圖2膽固醇代謝相關(guān)基因表達
3 討論
生物化學(xué)理論認為細胞通過(guò)以下機制調節自身膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡［6］：1）抑制3羥3甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶，減少自身的膽固醇合成；2）減少LDL受體的合成，從而減少LDL的攝取；3）激活內質(zhì)網(wǎng)脂酰基CoA膽固醇酰基轉移酶，使游離膽固醇在胞質(zhì)內酯化成膽固醇酯貯存。本研究探討抗性淀粉（RS）干預膽固醇代謝的調節機制。許多研究已證實(shí)，RS在結腸微生物作用下發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（SCFA）可被結腸上皮細胞利用和通過(guò)肝門(mén)靜脈進(jìn)入血循環(huán)，影響肝臟中膽固醇代謝，降低正常和高膽固醇大鼠的血膽固醇濃度［7, 8］。并認為這種降膽固醇作用的機制可能是：增加糞便中膽汁酸的排泄，結腸發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸抑制肝臟膽固醇合成，但其分子機制仍未十分清楚。我們于前期的動(dòng)物實(shí)驗和臨床試驗均已證實(shí)；RS可降低糖尿病大鼠及2型糖尿病患者的血膽固醇水平［3］。本研究結果也顯示：RS干預組TC、HDLC、LDLC及TC／HDLC比值較對照組有顯著(zhù)降低（P＜005＝，RS干預組之間TC、HDLC、LDLC也產(chǎn)生顯著(zhù)差異（P＜005＝。即隨著(zhù)RS攝入量增加血膽固醇水平隨之降低，并存在劑量反應關(guān)系。故此，本研究著(zhù)重從以下方面闡述RS干預膽固醇代謝的機制。
①對膽固醇代謝關(guān)鍵酶的影響
膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7 alphahydroxy2lase, CYP7A1）是膽固醇轉化為膽汁酸經(jīng)典途徑的關(guān)鍵酶，膽固醇在肝臟內受其催化生成7α羥膽固醇，后者經(jīng)一系列反應轉化為膽汁酸。這是膽固醇代謝的主要去路。據研究報道，膳食纖維可能通過(guò)升高膽固醇7α羥化酶活性或通過(guò)抑制膽固醇合成來(lái)加速膽固醇代謝［9］。果膠不僅能抑制肝臟HMGCoA還原酶的活力，尚可阻止膳食膽固醇引起的倉鼠CYP7A1活力的下降。本研究顯示：RS干預組大鼠CYP7A1 mRNA 的表達水平明顯高于對照組，推測可能由此提高了CYP7A1活性，促進(jìn)膽固醇轉化為膽汁酸，進(jìn)而加速膽固醇從機體的排泄。
②對細胞膜受體的影響
血中膽固醇主要由低密度脂蛋白（LDL）攜帶運輸，借助細胞膜上的LDL受體介導的內吞作用進(jìn)入細胞, 并在細胞內進(jìn)行分解代謝，最終從血漿中清除。因此, 脂蛋白受體途徑是脂蛋白在血漿中分解代謝后最終從血漿中清除的重要途徑之一，并與體內膽固醇調節密切相關(guān)［10］。肝細胞表面上有LDL的特異受體，LDL通過(guò)其apoB的正電荷精氨酸殘基與此受體結合。結合的LDL在細胞表面的凹陷結構內被表面膜包成小泡并與內吞體融合，由于內吞體內的酸性環(huán)境，LDL從受體上釋放下來(lái)，被運送到溶酶體。在溶酶體中LDL的蛋白組分和脂類(lèi)組分都被水解，后者進(jìn)一步被轉化成游離的膽固醇和脂肪酸。而釋放下來(lái)的LDL受體重新返回到細胞表面［11］。本研究顯示：RS干預組大鼠LDLR mRNA的表達水平明顯高于對照組，說(shuō)明RS增強了細胞LDLR mRNA的表達，進(jìn)而使細胞膜LDL受體數目增多，LDL受體活性升高，清除血中膽固醇能力增強，導致血膽固醇水平下降。
人體內2／3的LDLC是通過(guò)LDL受體途徑降解的，還有另一個(gè)降解途徑，就是通過(guò)肝清除細胞的吸入降解LDLC。RS干預組大鼠肝臟清除細胞B1受體（SRB1）mRNA 表達水平的顯著(zhù)增高，說(shuō)明RS增強了SRB1 mRNA的表達，增強了此受體的活性，進(jìn)而也增強了清除血中膽固醇能力，導致血膽固醇水平下降。
③對膽固醇及膽汁酸吸收排泄的影響
關(guān)于RS影響膽固醇及膽汁酸吸收和排泄的機制。可能有以下幾方面［12~14］ ：1）吸附或結合膽固醇及膽汁酸，增加其腸道排出；2）具有凝膠特性的RS在腸道內形成凝膠，影響膽固醇與消化酶、膽汁酸微團及腸粘膜的接觸；3）加速腸蠕動(dòng)，縮短腸內容物在腸道的停留期；4）結腸代謝物SCFA具有的降膽固醇作用。
本研究結果顯示：腸道內乙酸、丙酸、丁酸及總SCFA含量，高RS組與對照組相比有顯著(zhù)增加，由此推測SCFA具有降血膽固醇的作用。據報道，丙酸鹽在游離大鼠肝細胞中可抑制膽固醇合成率達45%；在大鼠體內也能象某些可溶性纖維一樣降低血漿及肝膽固醇水平，加入05%的丙酸鹽即可見(jiàn)效，同時(shí)測定肝功能及進(jìn)行肝臟組織學(xué)檢查未見(jiàn)不良影響。推測此作用可能與抑制肝臟膽固醇合成有關(guān)，尤其是抑制HMGCoA還原酶［15,］。Mather和Dawsony［16］報道喂食不同飼料的大鼠腸道丁酸含量與腸內容物轉運時(shí)間呈負相關(guān)。KyuHo Han［17, 18］等研究表明丁酸含量與糞便總膽汁酸濃度呈明顯正相關(guān)（r＝0874，P＜001），腸道中總SCFA水平也與膽汁酸濃度呈正相關(guān)（r＝0841，P＜001）。
本研究結果還顯示：RS干預組糞便及盲腸內容物pH值顯著(zhù)下降，其重量顯著(zhù)增加。推測可能是RS增加腸道膽汁酸及固醇類(lèi)物質(zhì)的排泄有關(guān)，但因檢測條件所限，未能進(jìn)一步檢測糞便及腸內容物中膽汁酸及固醇類(lèi)物質(zhì)的含量，有待在下一步實(shí)驗中完善。
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