梁惠1張秀珍1賀娟1，2逄丹1馬愛(ài)國1
（1青島大學(xué)醫學(xué)院，青島，266021；2青島大學(xué)醫學(xué)院附屬醫院，青島，266003）

摘要：目的通過(guò)對D—半乳糖誘導的氧化損傷小鼠補充不同劑量海兔素，觀(guān)察其對DNA損傷和機體抗氧化能力的影響。方法1、體內實(shí)驗進(jìn)行海兔素的抗氧化活性評價(jià)：采用昆明種小鼠60只，隨機分為空白對照組，低、中、高劑量實(shí)驗組、維生素E對照組和模型對照組，分別以0（注射生理鹽水）、20mg／kg(低劑量組)、40mg／kg(中劑量組)、80mg／kg(高劑量組)海兔素、40mg／kg(維生素E組)灌胃及模型對照組（吐溫80灌胃），2、除空白對照組外，其他五組小鼠頸背皮下注射D—半乳糖生理鹽水液，劑量400mg／kg BW，建立氧化損傷動(dòng)物模型，實(shí)驗期為30天。3、末次給藥24小時(shí)后，眼眶取血處死動(dòng)物。采用單細胞凝膠電泳法測定DNA損傷狀況；高效毛細管電泳法測定血漿中O6甲基鳥(niǎo)嘌呤（O6MeG）的含量；以試劑盒測定血漿中SOD、GSHPX活性及MDA和含量。結果海兔素各劑量組的血淋巴細胞自發(fā)性損傷無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005）。當加入10μmol／L H2O2處理后，海兔素中、高劑量組及維生素E組淋巴細胞DNA損傷與模型對照組比較顯著(zhù)降低，差異具有統計學(xué)意義（P＜005）；中、高劑量海兔素組及維生素E組血漿中O6甲基鳥(niǎo)嘌呤含量明顯降低，差異具有顯著(zhù)性（P＜005）。海兔素各劑量組及維生素E組小鼠血中MDA的含量與模型對照組比較均顯著(zhù)降低，差異有顯著(zhù)性(P＜005)。海兔素中劑量組及維生素E組小鼠血中SOD、GSHPX活性與模型對照組比升高，差異有統計學(xué)意義(P＜005)。結論海兔素可有效地降低H2O2誘導的DNA氧化損傷和減少DNA烷化損傷產(chǎn)物O6MeG的生成，提高血漿中SOD、GSHPX活性，降低血中MDA含量，體內具有一定的抗氧化作用。
關(guān)鍵詞：凹頂藻；海兔素；DNA損傷；SOD；MDA；GSHPX；抗氧化

Studies on the Antioxidant Activities of AplysinLIANG Hui1, ZHANG Xiuzhen1,HE Juan1,2, PANG Dan1,MA Aiguo1
1 Medical College,Qingdao University,Qingdao266021, China
2 Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003, China

Abstract: Objective To investigate the antioxidant activities of various dosages of aplysin in mice. Design-60 kunming mice were randomly divided into 6 groups. Except for the blank group,all the mice in the other 5 groups were injected with Dgalactose at the dose of 400mg／kg bw to the abdominal cavity to induce the oxidant damage model. Each of the supplement groups was given aplysin (20,40,80 mg／Kg bw), VitE(40mg／Kg bw)respectively, while the blank group was given saline and the model group was given towen80. DNA oxidized damage was analyzed by SCGE. The content of O6MeG was measured by P／ACE. Levels of SOD, MDA, and GSHPx activies in plasma were measured with test kits. ResultsThere was a significant decreasing tendency of the oxidative DNA damage on peripheral lymphocytes in the aplysin 40mg／Kg bw, 80mg／Kg bw and VitE 40mg／Kg bw supplement group by 10μmol／L H2O2compared with blank group. The levels of O6MeG in plasma in the aplysin 40mg／Kg, 80mg／Kg supplement group and VitE (40mg／Kg) were significantly lower than the blank group (P＜005). Plasma SOD and GSHPX activities in the aplysin 40mg／Kg, 80mg／Kg and VitE（40mg／Kg） supplement groups were higher than the blank group (P＜005) . The levels of MDA in every supplement groups were significantly lower than the blank group (P＜005).; ConclusionsThe study indicated that aplysin could enhance antioxidantive activities,such as strength the activities of antioxidative enzyme SOD and GSHPx, and lower the level of MDA .Aplysin can also decreased DNA damage effectively in the oxidant damage mice.
Keywords： laurencia; aplysin; DNA damage; superoxide dismutase;  MDA; GSHPx glutathione peroxidase; antioxidants.

萜類(lèi)化合物因其結構獨特、生物活性強，很久以來(lái)引起人們的廣泛關(guān)注［1］。近十幾年來(lái)，僅從凹頂藻屬中就分離出400多種萜類(lèi)化合物，代表著(zhù)26種類(lèi)型結構骨架，是海洋萜類(lèi)化合物的重要來(lái)源［2，3］。本文從三列凹頂藻提取物中分離純化得到溴代倍半萜海兔素，并應用動(dòng)物實(shí)驗和分子生物學(xué)的方法，觀(guān)察三個(gè)不同水平海兔素對D—半乳糖誘導的氧化損傷小鼠抗氧化能力和DNA損傷的影響，為安全、合理開(kāi)發(fā)具有高度生物活性的新的海洋藥物提供科學(xué)依據。1 材料與方法
11 材料
111 三列凹頂藻（Laurencia tristicha Tseng,Chang,E.Z.et.B.M.Xia）屬紅藻門(mén)(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae),仙菜目(Ceramiales)，仙菜科(Cermiaceae),凹頂藻屬(Laurencia)，中國科學(xué)院海洋研究所提供并鑒定。倍半萜海兔素（Aplysin）由本室經(jīng)反相HPLC分離純化得到，以吐溫-80溶解成所需的濃度。
112 實(shí)驗動(dòng)物:青島市實(shí)驗動(dòng)物中心提供純種昆明小鼠，雌雄各半，體重18-23g，隨機分組。
12 方法
121 動(dòng)物喂養60只昆明小鼠購進(jìn)后適應性喂養一周，按體重隨機分為空白對照組，低、中、高劑量實(shí)驗組、維生素E對照組和模型對照組，10只／組，雌雄各半，分籠喂養。分別以生理鹽水（空白對照組、）、20mg／kg(低劑量組)、40mg／kg(中劑量組)、80mg／kg(高劑量組)海兔素、40mg／kg維生素E（維生素E組對照組）及吐溫-80（模型對照組）灌胃，每天1次，連續30天，同時(shí)除空白對照組外，其他五組小鼠均每天頸背皮下注射D—半乳糖生理鹽水液，劑量400mg／kg BW，建立氧化損傷動(dòng)物模型。
122 觀(guān)察指標末次給藥24小時(shí)后，眼眶取血，進(jìn)行如下指標測定。
1221 淋巴細胞DNA損傷檢測
12211 試劑
正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖、RPMI1640（來(lái)自GibicoBRL公司），熒光劑DAPI(46Diamidine2Phenlindoledihydrochloride)由Boehringer Mannheim公司提供。Tris由Amresco公司提供；DPH(1,6Diphenyl1,3,5hexatriene)美國Sigma公司產(chǎn)品；小牛血清購自Gibico公司，淋巴細胞分離液由愛(ài)普生物技術(shù)公司提供，乙二胺四乙酸，磷酸二氫鈉等為國產(chǎn)AR級試劑。
12212 儀器
低溫離心機（德國Sigma 3K30型），低溫冰箱，電泳儀，制冰機（英國IM20K型），熒光顯微鏡（日本OLYMPAS BH2型）。
12213 實(shí)驗方法
采用單細胞瓊脂糖凝膠電泳（singalcell gel electrophoresis,SCGE）技術(shù)。參照Colins等的方法，取新鮮抗凝血35μL加入盛有1640和小牛血清的離心管中，0℃培養30分鐘，取淋巴細胞分離液100μL加到該離心管的最低層，離心，取淋巴細胞層移入磷酸緩沖液中，加入10μmol／LH2O2處理5min，離心，去上清放入冰水浴中備用。取1%融化的標準瓊脂糖85μL滴在載玻片上，4℃放置510min，取1%融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖85μL和上述淋巴細胞混勻滴在第一層瓊脂薄板上，放入溶解液中處理60min后，4℃電泳30min，中和液中和，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀(guān)察。每種處理觀(guān)察100個(gè)細胞，計算其損傷單位［4］。
1222 血漿O6甲基鳥(niǎo)嘌呤（O6MeG）的測定，采用高效毛細管電泳法［5］。
儀器與試劑：
P／ACE5000型全自動(dòng)毛細管電泳儀，配有紫外檢測器，用Gold軟件控制儀器操作數據采集（美國B(niǎo)eckman儀器公司提供），毛細管（75umid×57cm）。O6MeG標準品購自Sigma公司，硼砂緩沖液由Beckman公司提供。
1233 血清脂質(zhì)過(guò)氧化指標測定
超氧化物歧化酶（SOD）采用羥胺法；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）采用DTNB直接法。
13 統計分析
實(shí)驗結果采用SPSS110統計軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2 結果
21 海兔素對DNA損傷的影響
海兔素補充組和各對照組的淋巴細胞DNA自發(fā)性氧化損傷均較低，各組間無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005），而誘發(fā)氧化損傷（加入10μmol／L H2O2）明顯加重。海兔素中、高劑量組及維生素E組淋巴細胞DNA損傷與模型對照組比較顯著(zhù)降低，差異具有統計學(xué)意義（P＜005）；中、高劑量海兔素組及維生素E組血漿中O6甲基鳥(niǎo)嘌呤含量明顯降低，差異具有顯著(zhù)性（P＜005）(表1)
22 海兔素對機體抗氧化活性的影響
結果顯示，與空白對照組比較，模型組動(dòng)物血紅細胞SOD、及GSH—Px活力明顯降低，MDA的含量升高(P＜005)，表明造模是成功的。與模型組比較，海兔素各劑量補充組及維生素E組小鼠血中MDA的含量均降低，差異有顯著(zhù)(P＜005)。海兔素中劑量組及維生素E組小鼠血中SOD、GSHPX活性升高，差異有統計學(xué)意義(P＜005)。(表2)

3 討論
本研究探討了三種不同水平海藻溴代倍半萜海兔素對D—半乳糖誘導的氧化損傷小鼠DNA損傷和機體抗氧化能力的影響。結果表明，經(jīng)過(guò)4周補充，海兔素能顯著(zhù)降低機體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平并能提高機體抗氧化酶活性，同時(shí)，DNA誘發(fā)氧化損傷及烷化損傷程度則明顯下降，說(shuō)明補充海兔素對DNA損傷的防護作用與其具有抗氧化活性有關(guān)。
正常情況下，機體的氧化和抗氧化處于一種動(dòng)態(tài)的平衡中。但由于各種原因如外源性毒物、電離輻射、機體自身的抗氧化防御體系受損等，均可使機體的自由基水平明顯增高，導致機體的氧化應激［6］。本實(shí)驗中動(dòng)物連續注射D—半乳糖后，因其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能進(jìn)一步代謝而堆積在細胞內，導致細胞腫脹，使動(dòng)物組織細胞出現DNA損傷以及功能改變。同時(shí)，D—半乳糖具有氧化劑的作用，在體內氧化產(chǎn)生大量自由基，當機體自由基的產(chǎn)生過(guò)多或清除能力下降時(shí)，可導致細胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、酶失活、核酸和染色體破壞。然而具有抗氧化作用的自由基清除劑可以調節氧化和抗氧化平衡，維持機體的正常功能。體內除了酶系統如SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等能有效地清除自由基外，抗氧化營(yíng)養素則作為第二道防線(xiàn)發(fā)揮抗氧化作用。海兔素作為一種具有（C5H8）n結構的萜類(lèi)化合物，含有豐富的烯鍵，化學(xué)性質(zhì)比較活潑，易發(fā)生加成反應，具有較強的還原性，因此能有效地與強氧化劑起反應，保護細胞膜和線(xiàn)粒體膜中的不飽和脂肪酸不被氧化，維持膜的完整性和功能，是自由基有效的淬滅劑和捕捉劑。本實(shí)驗結果顯示中劑量（40mg／kg）組海兔素抗氧化水平與維生素E接近，在體內具有較強的抗氧化活性。
近幾年研究認為［7,8］，O6MeG是DNA受到環(huán)境致癌物（主要是烷化劑）及各種細胞毒性物質(zhì)的甲基化作用而形成的代謝產(chǎn)物。由于O6MeG能使堿基錯誤地配對，從而誘導細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，被認為是一種潛在的致癌物，是各種烷化損傷中對細胞危害最大的一種致突變前體物質(zhì)。本實(shí)驗結果表明中、高劑量海兔素能夠明顯降低血漿中O6甲基鳥(niǎo)嘌呤含量，作用與維生素E接近，說(shuō)明海兔素作為一種有效的抗氧化劑對機體烷化損傷具有一定的保護作用。
單細胞瓊脂糖凝膠電泳(SCGE),也稱(chēng)彗星電泳(cometassay)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、敏感、簡(jiǎn)便的ＤＮＡ斷裂損傷分析技術(shù)［9］。實(shí)驗發(fā)現，經(jīng)過(guò)4周補充，各實(shí)驗組的血淋巴細胞自發(fā)性損傷無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005）。當加入10μmol／L H2O2處理后，海兔素中、高劑量補充組及維生素E組淋巴細胞DNA損傷與模型對照組比較顯著(zhù)降低，說(shuō)明一定劑量的海兔素在體內可有效改善H2O2誘發(fā)的DNA損傷狀況。
海兔素作為一種天然萜類(lèi)化合物，能顯著(zhù)降低機體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平并能提高機體抗氧化酶活性，同時(shí)，對DNA誘發(fā)氧化損傷及烷化損傷有一定保護作用。前期工作表明，海兔素具有良好的抑瘤和免疫調節作用。因此，海兔素作為一種新型的海洋活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。