摘要：目的研究枳實(shí)提取物的抗氧化性質(zhì)。 方法采用超氧陰離子自由基、羥自由基的生成體系研究枳實(shí)提取物對自由基的清除能力及對小鼠肝、腎、心組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用。結果枳實(shí)提取物具有強的自由基清除能力及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力并呈現線(xiàn)性關(guān)系，其中枳實(shí)醇提物較水提物具有強的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。結論枳實(shí)提取物能有效清除超氧陰離子、羥自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值。
關(guān)鍵詞：枳實(shí)；羥自由基；氧自由基；脂質(zhì)過(guò)氧化；抗氧化

Study on the Antioxidant Activity of Citrus
Aurantium Extract in Vitro
JiaoShirong1、2HuangChengyu1SongWeiwei2
(1School of public health,Sichuan university,Chengdu 610041,China;
 2 School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039, China )

Abstract: ObjectiveAbility for antioxidative activity Citrus aurantium extract in vitro was studied. Methodthe ability of free radicals scavenging was investigated with different special chemical systems of hydroxyl radical and superoxide radicals and inhibitor lipidperoxidation with homogenates of mouse liver, kidney and heart. ResultC.aurantium extract had strong ability of free radicals scavenging and inhibitor lipidperoxidation . A linear relationship existed between free radicals scavenging and inhibitor lipidperoxidation and C.aurantium extract, especially C.aurantium ethanol extract was higher inhibitor lipidperoxidation than C.aurantium water extract. ConclusionThe extract of C.aurantium can effectively scavenge free radicaland and inhibitor lipidperoxidation significantly, which is studing in the further.
Keywords: C.aurantium L; hydroxyl radical; superoxide radicals; lipidperoxidation; antioxidative

枳實(shí)（Citrus Aurantium，ZhiShi）為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果。具有破氣除痞、化痰消積的功效，是中醫臨床常用藥物［1］。
經(jīng)HPLCESMS分析，枳實(shí)中含有異柑苷、柑苷、橘皮苷、新橘皮苷、柚皮素、橙皮苷等八種類(lèi)黃酮，并具有高含量［2］。研究表明柑橘類(lèi)黃酮具有健康保護作用，如抑制人乳腺癌細胞、抗突變作用［3］。橘皮苷能影響血管的通透性，柚皮苷具有抗氧化作用［4］保護脂質(zhì)避免過(guò)氧化［5］。
近年來(lái)，國內外開(kāi)展蕓香科植物，如胡柚等抗氧化性方面的研究，結果顯示，有清除自由基的作用，而關(guān)于枳實(shí)的抗氧性研究未見(jiàn)報道。本試驗在提取枳實(shí)抗氧化物質(zhì)的基礎上，考查枳實(shí)提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力，抑制小鼠肝、腎、心組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化能力，為進(jìn)一步深入研究枳實(shí)的抗氧化作用奠定基礎。
1材料與方法
11 材料與試劑
枳實(shí)購買(mǎi)自成都中藥材市場(chǎng)（經(jīng)鑒定為酸橙幼果Citrus aurantium L）；蘆丁標準品：生化試劑，北京生物制品檢定所；槲皮素，生化試劑，Fluka 公司；Folinciocalteuphenol reagent（福林酚試劑），Sigam公司；其余試劑均為分析純。清潔級昆明小鼠，雄性，體重20～30g，由四川大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供。
12 實(shí)驗方法
121 枳實(shí)提取方法
枳實(shí)醇提物（ZhiShi ethanol extract,ZSEE）：枳實(shí)粉碎，以乙醇（70%），料液比1：30，溫度80℃，提取3次，每次2h，合并濾液，60℃真空濃縮，冷凍干燥，得淺棕色粉末。
枳實(shí)水提物(ZhiShi water extract,ZSWE)：枳實(shí)粉碎，料液比1：30，溫度100℃，提取3次，每次30min，合并濾液，真空濃縮，冷凍干燥，得棕色粉末。
總黃酮測定（分光光度法，蘆丁為標準）［6］：取一定濃度樣品，加30％的乙醇至5mL，先加5％的亞硝酸鈉溶液03mL，搖勻．放置6分鐘，再加10％的硝酸鋁溶液03mL，搖勻，再放置6分鐘，加4％的NaOH 4mL,各用蒸餾水稀釋至10mL，放置15～20分鐘，在波長(cháng)510nm處測定吸光度（蒸餾水作空白），按回歸方程計算。回歸方程C=09385A-00091。相關(guān)系數 R2=09995，
公式p=C×V×m×1000〖〗W×V1×100
式中p表示總黃酮類(lèi)物質(zhì)含量(g／100g)，C表示從回歸方程計算得樣品中黃酮類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量(mg)，n表示稀釋倍數，V表示濃縮液的體積(mL)，W表示枳實(shí)投料量(g)。
123 總多酚類(lèi)物質(zhì)含量的測定（福林酚比色法，沒(méi)食酸子酸為標準）［6］：準確稱(chēng)取適量樣品，用水溶解，濃度在008mg／ml左右。取1ml樣品液加到10ml比色管中，依次加入去離子水1ml，福林酚試液05ml、267%Na2CO3溶液15ml，然后以水定容至10ml，室溫下反應2h，在760nm處測其吸光度。按回歸方程計算。回歸方程C=89524A-031977。相關(guān)系數 R2=09991。
124 超氧陰離子自由基（C-2）清除能力［7］：參考文獻方法，取005mol ／ L , PH82的 TrisHCl緩沖液45ml于試管中，置 25℃水浴中預熱 20min，加入供試樣品01ml 25mmol／L鄰苯三酚04ml，混勻后在 25℃水浴中反應 4min，立即用8mmol／L的 HCL兩滴終止反應，并在 299士 1nm處測定吸收度（用蒸餾水調零）。空白組以01ml蒸餾水代替樣品，并按下式計算清除率：
d%=［（A空白A樣品）／A空白］×100%
125 羥自由基(·OH)的清除能力：采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥自由基（Fonton反應）方法［8］。取075mmol／L鄰二氮菲溶液1mL，PBS液2mL和蒸餾水1mL，充分混勻后，加075mmol／L硫酸亞鐵1mL，混勻，加001%的過(guò)氧化氫1mL，于37℃溫育60min，于536nm處測其吸光度，其值為AP。用1mL30％的乙醇代替1mL過(guò)氧化氫，測得吸光度為AB。用試樣1mL代替1mL蒸餾水，測得吸光度為AS。HO·自由基清除率（d%）計算公式：
d%=As-Ap〖〗AGAP×100%
126 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用［9］：小鼠處死后分別取肝、腎、心組織，洗凈血污，剪碎用生理鹽水制 3％勻漿。取此勻漿03ml加人各種試劑，反應液總體積為067ml，含不同質(zhì)量濃度樣品017ml , 00024%H2O2,003mmol／L FeSO401ml, 37℃保溫 60min，加人1ml 20%三氯醋酸及1ml067% TBA , 90℃保溫 15min后水冷，4000r／min離心 20min，取上清測定 A532nm，H2O代替TBA的平行實(shí)驗管為各實(shí)驗比色空白，蒸餾水代替藥液的反應管為H2O管，脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率I為：I%=［（A空白A藥液）／A空白］×100%。
13 統計分析
各組實(shí)驗數據經(jīng)SPSS115軟件處理，所得數據用均數±標準差表示，用方差分析進(jìn)行統計學(xué)檢驗。
2結果
21 枳實(shí)抗氧化物質(zhì)提取與分析
抗氧化物質(zhì)含量見(jiàn)表1。

22 枳實(shí)提取物對羥自由基的清除率
圖1結果表明，枳實(shí)醇提物及枳實(shí)水提物均有羥自由基清除作用，隨濃度的增加，對羥自由基的清除能力增強，并呈線(xiàn)性相關(guān)。

Fig1Ability for scavenging hydroxyl radical of C.aurantium extract

在同一體系中，清除自由基的能力可以用清除50%的自由基所需樣品的濃度來(lái)表示，即半抑制濃度IC50表示。IC50與自由基清除劑的清除能力成反比，即IC50越小，表明清除自由基的能力越強；反之亦然。
以槲皮素為標準，從表2可知，枳實(shí)醇提物比枳實(shí)水提物對羥自由基清除能力高，但均低于槲皮素。
23 枳實(shí)提取物對超氧陰離子的清除率從圖2可以得到，枳實(shí)醇提物及枳實(shí)水提物均有超氧陰離子清除作用，隨濃度的增加，對超氧陰離子的清除能力增強，并呈線(xiàn)性相關(guān)。
以槲皮素為標準，從表3可知，枳實(shí)水提物比枳實(shí)醇提物對超氧陰離子自由基清除能力大，并與槲皮素清除作用接近。

Fig2Ability for scavenging superoxide radicals of C.aurantium extract

Fig3Ability for inhibitor lipidperoxidation of mouse live of  C.aurantium extract

241 小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用
從圖3可以得到，枳實(shí)提取物對小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，并呈線(xiàn)性相關(guān)。
24 枳實(shí)提取物對脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用
242 小鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用
從圖4可以得到，枳實(shí)提取物對小鼠腎組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，并呈線(xiàn)性相關(guān)。

Fig4Ability for inhibitor lipidperoxidation of
mouse kidney of  C.aurantium extract

243 小鼠心組織脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用
從圖5可以得到，枳實(shí)提取物對小鼠心組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，并隨濃度增加抑制作用增強。

Fig5Ability for inhibitor lipidperoxidation of mouse heart of  C.aurantium extract

Fig6 50% of inhibitor lipidperoxidation of C.auIrantium extract
圖6可看出枳實(shí)醇提物對小鼠肝勻漿IC50=0474mg／ml，枳實(shí)水提物IC50=13389mg／ml；枳實(shí)醇提物對小鼠腎臟勻漿IC50=1011mg／ml，枳實(shí)水提物IC50=11031mg／ml；枳實(shí)醇提物對小鼠心臟勻漿IC50=0521mg／ml，枳實(shí)水提物IC50=8355mg／ml。枳實(shí)提取物對組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，且枳實(shí)醇提物的抑制作用強于枳實(shí)水提物。
3討論
研究表明，氧化損傷是導致癌癥和慢性疾病的一個(gè)重要機制，對蔬菜水果包括柑橘類(lèi)的攝入量高，可降低心血管疾病和患癌癥的風(fēng)險［10-12］，蔬菜水果中含有黃酮類(lèi)物質(zhì)，其具有清除自由基和降低氧化損傷帶來(lái)的副作用，研究發(fā)現多酚類(lèi)是一種強的抗氧化物質(zhì)，黃酮類(lèi)物質(zhì)、花色苷等可作為抗氧化藥物對心血管起保護作用［13,14］。柑橘類(lèi)水果在降低局部缺血的風(fēng)險中也起到一個(gè)特殊作用［15］。
我們的研究發(fā)現醇提枳實(shí)總黃酮比水提枳實(shí)高15倍，總多酚含量高25倍，同時(shí)枳實(shí)醇提物比水提物具有高的清除羥自由基和超氧陰離子的作用，提示高的總黃酮和多酚含量對羥自由基的清除起著(zhù)重要作用這也與文獻［15］報道一致。
枳實(shí)水提物比醇提物具有高的清除氧自由基的能力，提示水提物中可能含有Vc、多糖類(lèi)等物質(zhì)提高了對氧自由基的清除活性。
研究發(fā)現脂質(zhì)過(guò)氧化的程度反映了機體自由基活性的高低及機體遭受自由基損傷的程度。自由基誘導的脂質(zhì)過(guò)氧化反應與許多疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，如炎癥、老年性白內障、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆、糖尿病并發(fā)癥、衰老等。枳實(shí)醇提物和水提物均能抑制小鼠肝、腎、心組織勻漿的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，且醇提物的抑制作用高于水提物，提示枳實(shí)可能作為一種食品補充劑，降低氧化損傷帶來(lái)的心血管疾病及慢性病的風(fēng)險。
本試驗中提取物對羥自由基和超氧陰離子的清除作用均低于槲皮素，可能是由于粗提物中的有效活性成分低于純的槲皮素，同時(shí)和類(lèi)黃酮的結構相關(guān)，需要在今后的工作中進(jìn)一步對提取物進(jìn)行分離和純化和結構鑒定。
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