摘要：目的從光皮木瓜中提取多酚類(lèi)物質(zhì)，確定多酚類(lèi)成分及含量，測定光皮木瓜多酚的抗氧化活性。方法將光皮木瓜分為水提物和醇提物部位，采用酶解方法處理原料進(jìn)行對比實(shí)驗，分光光度法測定其總酚、單寧和黃酮類(lèi)含量；薄層色譜定性分析其單體成分；DPPH自由基清除實(shí)驗測定其抗氧化性能。結果：光皮木瓜提取物總酚為1801676mg／100g鮮重，其中單寧935525mg／100g鮮重，黃酮類(lèi)294523mg／100g鮮重，酶解有助于多酚含量的提高；薄層色譜做定性分析顯示含有兒茶素單體和綠原酸；DPPH自由基清除實(shí)驗表明水提物較醇提物活性強，酶解后各部位活性均增強。結論光皮木瓜提取物多酚類(lèi)物質(zhì)含量很高并有強烈抗氧化活性。
關(guān)鍵詞：光皮木瓜；多酚；單寧；黃酮類(lèi)；DPPH自由基

Polyphenol Contents and Antitoxidant Activity of
 Chaenomeles Sinesis ExtractZhang ting，Mi Mantian*，Tang yong，Zhao jing
（Institute Of Nutrition And Food Hygeine Of TMMU,Chongqing,400033,China）

Abstract: Objective the contents of polyphenol classes and antitoxidant activity in the Chaenomeles sinesis were evaluated. methodstotal polyphenols,tannins and flavonoids were determined spectrophotometrically, after extraction of plant material with aqueous and aqueous ethanol extracts, adding cellulose during processing for contrast;TLC for quantitation of single polyphenols and DPPH free radical scavenging activity test for antitoxidant evaluation of the extracts. resultsthe total polyphenols、tanins、flavoniods of Chaenomeles sinesis extracts were 1801676、935525mg／100g、294523mg／100gFW,and enzymatic process help increasing polyphenols contents；TLC showed catechin and chlorogenic acid existed;aqeous extract shows stronger DPPH free radical scavenging activity than aqeous ethanol extract,and adding cellulose could enhanced activity. conclusionpolyphenols contents in Chaenomeles sinesis extracts were high and it shows great DPPH free radical scavenging activity.
Keywords: Chaenomeles sinesis;polypheols;tannins;flavonoids;DPPH free radical

前言
木瓜為薔薇科植物帖梗海棠［Chaenomeles speciosa（sweet）Nakai］的成熟果實(shí)，主要分為兩大類(lèi)：皺皮木瓜（川木瓜、云木瓜、藏木瓜、日本木瓜等）和光皮木瓜（山木瓜）,實(shí)驗所用材料為光皮木瓜［Chaenomelessinesis(Touin)Koehne］屬于木瓜同科植物榠楂，在我國做為傳統的中藥材具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò )的功效［1］。研究發(fā)現光皮木瓜含有豐富的膳食纖維［2］和有機酸，特別是含有大量的酚類(lèi)物質(zhì)［3］和VitC，多酚包括單寧（原花青素）、黃酮類(lèi)及各種酚酸等成分，是一種很有潛力的抗氧化劑，抗氧化劑無(wú)論在體內還是體外均有很強的自由基清除作用，在對癌癥，心血管的治療中具有重要作用。近年來(lái)天然的抗氧化劑特別是多酚類(lèi)物質(zhì)的研究比較多，葡萄多酚，蘋(píng)果多酚更是研究的熱點(diǎn)。國內外關(guān)于光皮木瓜中酚類(lèi)物質(zhì)和抗氧化能力的報道非常少［4］，國內僅集中于木瓜飲片中簡(jiǎn)單成份的分析。本文采用纖維素酶解的新工藝，對比了光皮木瓜水提物和醇提物以及酶解與未酶解處理原料得到提取物的多酚類(lèi)物質(zhì)的含量，薄層色譜分析定性其中單體類(lèi)成份，并做DPPH自由基清除效應實(shí)驗測定其抗氧化活性。
材料與方法
11 試驗材料
光皮木瓜（chinese quince）購自綦江縣打通木瓜基地。
12 試劑和儀器
主要試劑：DPPH（2,2Diphenyl1picrylhydrazyl,二苯代苦味酰肼自由基, SIGMA 公司）；FolinCiocalteu試劑（第三軍醫大學(xué)生化教研室試劑中心）；干酪素（分析純）；蘆丁、槲皮素、綠原酸、沒(méi)食子酸、兒茶素標準品（中國藥品生物制品檢定所）；原花青素標準品（天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司）；其余試劑為分析純。
主要設備；聚酰胺薄層板；紫外分光光度計（北京普析通用設備有限公司）。
13 實(shí)驗方法
131 原料提取
7月份新鮮采集光皮木瓜洗凈，去核、切丁，稱(chēng)取兩份相同重量的木瓜分別加水打漿，得勻漿，向其中一份勻漿加入1%纖維素酶，放入搖床中震搖酶解（45°，30min），將酶解和未酶解的勻漿冷凍離心，得上清液水提物（CS和CEs）和沉淀，將沉淀用一定濃度有機溶劑回流提取一定時(shí)間，過(guò)濾得醇提物（Cr和CEr）。
132 提取溶劑的確定
分別用50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇、無(wú)水甲醇和無(wú)水丙酮作為溶劑按照以上工藝提取一次，過(guò)濾得濾液，定容至100ml得待測液。用FolinCiocalteu法測定測定濾液中總酚含量。
133 提取次數的確定
稱(chēng)取5g沉淀，量取25ml50％乙醇溶液，混合，85℃回流提取1h；
過(guò)濾，無(wú)水乙醇定容至100ml（S）；
量取25ml95％乙醇溶液，與殘渣混合，85℃回流提取1h；
過(guò)濾，合并兩次濾液，無(wú)水乙醇定容至100ml(D)；
量取25ml95％乙醇溶液，與殘渣混合，85℃回流提取1h；
過(guò)濾，合并三次濾液，無(wú)水無(wú)水乙醇定容至100ml(T)。
單次提取按照步驟1-2，兩次提取按照步驟1-4，三次提取按照步驟1-6。在第一次提取過(guò)程中，大部分的多酚類(lèi)物質(zhì)被提取，因此，在第二次和第三次提取是采用了更強極性的溶劑（95％乙醇）。得三種濾液S、D、T。用無(wú)水乙醇分別定容三種濾液至100ml，隔夜，過(guò)濾，去沉淀，得濾液用FolinCiocalteu法測定測定濾液中總酚含量。
134 總酚的測定
總酚含量的測定采用FolinCiocalteu法［5］并稍做改良。精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸30mg，溶于100ml無(wú)水乙醇中，制成03mg／ml的沒(méi)食子酸標準溶液。分別吸取此溶液0，01，02，04，06，08，10ml（相當于沒(méi)食子酸0，30，60，120，180，240，300ug）于45ml具塞離心管中，蒸餾水定容至10ml處，加入05mlFolinCiocalteu試劑，75％無(wú)水碳酸鈉溶液定容至20ml，放置30min，于765nm處測定吸光值。
分別吸取待測樣品溶液CS、CES、Cr、CEr 01ml于45ml具塞離心管中，蒸餾水定容至10ml處，以后步驟同標準曲線(xiàn)的制備。以mg沒(méi)食子酸當量（GAE）／100g鮮果重示多酚含量。實(shí)驗均為三重復。
135 單寧的測定［6］
用干酪素振搖吸附單寧后，采用FolinCiocalteu法測定單寧含量。分別吸取01ml待測樣品CS、CES、Cr、CEr于15ml離心管中，加水定容至10ml后傾入100ml三角瓶中，加入精密稱(chēng)取的100mg干酪素，混勻，放入搖床中振搖后（150r／min，45min），拿出過(guò)濾，得濾液照所述方法測定未被吸被吸附的酚類(lèi)物質(zhì)含量，用總酚含量減去干酪素吸附單寧后測得酚類(lèi)含量即可得到單寧含量。以mg沒(méi)食子酸當量（GAE）／100g鮮果重示單寧含量。實(shí)驗均為三重復。
136 黃酮類(lèi)的測定
黃酮類(lèi)含量的測定采用中國藥典2000年版一部附錄VB并稍做改良。精密稱(chēng)取蘆丁20mg，溶于100ml無(wú)水乙醇中，制成02mg／ml的蘆丁標準溶液。分別吸取標準溶液0、01、02、04、06、08、10ml（相當于蘆丁0、20、40、80、120、160、200ug）于25ml容量瓶中，蒸餾水定容至6ml處，加入5%亞硝酸鈉1ml，搖勻，放置6min，加入10％硝酸鋁1ml，搖勻，放置6min，隨后加入4%氫氧化鈉10ml，加水至刻度25ml，搖勻，放置15min后，于500nm處測定吸光值。
分別吸取待測樣品溶液CS、CES、Cr、CEr 01ml于45ml具塞離心管中，蒸餾水定容至6ml處，
以后步驟同標準曲線(xiàn)的制備。以mg蘆丁／100g鮮果重示黃酮類(lèi)含量。實(shí)驗均為三重復。
137 多酚TLC定性分析
用毛細管定量5μl吸取標準對照品沒(méi)食子酸、綠原酸、兒茶素、蘆丁、槲皮素、原花青素和樣品CS、CES、Cr、CEr順序從左至右點(diǎn)于兩塊聚酰胺薄層層析板（10×20cm）上，分別放入層析缸中用展開(kāi)劑甲苯－丙酮－甲酸（3:3:1）［7］展開(kāi)，展開(kāi)后分別用鐵氰化鉀三氯化鐵還原試劑和1%三氯化鋁乙醇噴板顯色，后者在紫外燈下觀(guān)察；定量吸取對照品綠原酸、樣品CS、CES、Cr、CEr順序從左至右點(diǎn)于聚酰胺薄層層析板（10×10cm）上，放入層析缸中用展開(kāi)劑36％已酸展開(kāi)，展開(kāi)后用鐵氰化鉀三氯化鐵還原試劑噴板顯色。
138 DPPH自由基清除試驗
1381 樣品處理
分別吸取樣品溶液CS、CES、Cr、CEr01ml于1ml離心管中，蒸餾水定容至1ml，移取此溶液50、100、150、200、250μl于1ml離心管中，蒸餾水定容至1ml，制成不同濃度待測液。
1382 DPPH自由基清除率的測定
準確稱(chēng)取25mgDPPH，用無(wú)水乙醇溶解并定容于50ml，制成濃度為05mg／ml的DPPH溶液，量取此溶液24ml，用無(wú)水乙醇定容至100ml，制成濃度為012mg／ml的DPPH溶液。吸取2ml012mg／ml的DPPH溶液于05ml具塞離心管中，加入09mlTrisHcl（50Mm,PH74），02ml待測液，搖勻，以無(wú)水乙醇為參比于515nm處測定吸光值Ai。同時(shí)以02ml無(wú)水乙醇代替待測液做空白對照，測定吸光值Af。
根據以下公式計算清除率：
DPPH（％）＝（1－Ai／Af）×100%
式中，Ai為未加待測液時(shí)DPPH溶液的吸光值；
Af為加入待測液時(shí)DPPH溶液的吸光值；
1383 IC50的測定
IC50定義為DPPH清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑濃度，根據不同濃度抗氧化劑的清除率作曲線(xiàn)得出。
2 結果與討論
21 提取溶劑的確定
Fig1顯示，50％乙醇提取多酚的溶液用FolinCiocalteu試劑顯色后具有最大吸光值，因此選用50%乙醇做為提取光皮木瓜多酚的溶劑。
22 提取次數的確定
Fig2顯示，對沉淀部分進(jìn)行二次提取后溶液的吸光值高于一次提取，有必要對對沉淀部分進(jìn)行二次提取，但三次提物后溶液吸光值于二次相差不明顯，說(shuō)明三次提取對總酚量貢獻不大，考慮到成本等因素，對沉淀進(jìn)行兩次提取即可。
23 酶解對總酚的影響
纖維素酶是具有纖維素降解能力酶的總稱(chēng)，它們協(xié)同作用分解纖維素，半纖維素，促進(jìn)植物細胞壁的溶解使更多的植物細胞內溶物溶解出來(lái)，并能將大分子多糖、蛋白質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，減少對多酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響。從表中可以看出，未加纖維素酶處理的光皮木瓜水提物中多酚含量為529123mg／100g，醇提物中多酚含量為857473mg／100g，而加入1％纖維素酶后，水提物中多酚含量為586505mg／100g，醇提物中多酚含量為1215171mg／100g，分別提高了1084％和4172％，總酚提取提高了2994％，說(shuō)明采用酶解的方法對醇提物的影響較水提物大，總的來(lái)說(shuō)，酶解方法能夠顯著(zhù)提高多酚的提取率。

24 多酚、單寧和黃酮類(lèi)含量
本研究發(fā)現光皮木瓜中多酚含量很高，其中木瓜汁（水提物）中總酚含量為586505mg／100g，高于文獻報道的此品種木瓜（chaenomeles）中酚類(lèi)化合物含量為185～476mg／100g，可能與選用的木瓜品種和成熟度有關(guān)；國外學(xué)者僅研究了木瓜汁中多酚類(lèi)物質(zhì)含量［3］，但未有對榨汁后的木瓜殘渣中多酚測定的報道，本研究發(fā)現發(fā)現木瓜榨汁后的殘渣（醇提物）中含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，為1215171mg／100g，遠遠高于木瓜汁中多酚含量。據報道蘋(píng)果中多酚含量為298mg／100g、葡萄490mg／100g，黑醋梨1200mg／100g、黑莓300mg／100g、桑果420mg／100g、博以森樹(shù)莓440mg／100g、香蕉瓜450mg／100g、黑加侖620mg／100g，接骨木果990mg／100g，而按照此提取工藝所測得光皮木瓜中總酚含量應為水提物和醇提物中多酚含量之和1801676mg／100g鮮重，明顯高于上述所有水果總酚量。
單寧具有沉淀蛋白質(zhì)的能力，利用干酪素吸附單寧可得知定單寧含量［7］。光皮木瓜水提物中單寧含量為217125mg／100g鮮重，約占總酚含量的3702％，醇提物中為單寧含量為718400mg／100g鮮重，約占總酚含量的5912％，高于水提物中單寧含量，而總的單寧含量為935525mg／100g鮮重，約占總酚含量的5193％，這與日本學(xué)者［7］的研究結果光皮木瓜中含有大量的原花青素結果一致；對黃酮類(lèi)的測定結果顯示，光皮木瓜水提物中黃酮類(lèi)含量為294523mg／100g鮮重，醇提物中為289077mg／100g鮮重，分別占總酚的5022％和2379％，總黃酮為5836mg／100g鮮重，占總酚含量的3239％，關(guān)于光皮木瓜中黃酮類(lèi)的物質(zhì)的測定國外鮮有報道，僅國內學(xué)者有過(guò)研究［8］

24 TLC分析
噴鐵氰化鉀三氯化鐵還原試劑后薄層顯色為藍色斑點(diǎn)，由fig3可看出，水提物、醇提物以及葡萄籽原花青素成份較為相似，均有展開(kāi)劑不能展開(kāi)的成份停留在基線(xiàn)顯示出強烈的藍色斑點(diǎn)，此為大分子的鞣質(zhì)類(lèi)成份［7］，與d位置對比初步判斷光皮木瓜提取物中有兒茶素類(lèi)存在，為此我們噴以1%三氯化鋁顯色后觀(guān)察斑點(diǎn)位置和顏色，發(fā)現展開(kāi)的水提物、醇提物及葡萄籽原花青素展開(kāi)斑點(diǎn)與d、f、g在紫外燈下貫徹均顯示出黃色熒光，說(shuō)明有黃酮類(lèi)物質(zhì)的存在，為黃烷醇類(lèi)的兒茶素；fig4中停留在基線(xiàn)的為大分子鞣質(zhì)，隨展開(kāi)劑的展開(kāi)呈現出疊加的藍色斑點(diǎn)為不同聚合程度的原花青素［7］，與e對照可知樣品中存在綠原酸，但就顯色強度和斑點(diǎn)大小來(lái)看，水提物中綠原酸含量高于醇提物。

25 DPPH清除效應
251 DPPH體系穩定性
測定2mlDPPH在無(wú)水乙醇介質(zhì)中AU與時(shí)間的關(guān)系。結果顯示DPPH的吸光值在1h內，基本不變。因此所有樣品在1h內測定完畢是可靠的。
252 DPPH清除效應與多酚
從表可以看出，水提物的IC50(分別為0054mg／ml、0042mg／ml）小于醇提物的IC50（分別為0057mg／ml、0055mg／ml）；而酶解后的木瓜提取物IC50小于未處理組。說(shuō)明木瓜水提物的DPPH清除率大于醇提物，經(jīng)酶解后的木瓜提取物的DPPH清除率大于未經(jīng)酶解的木瓜提取物（fig2），以上結果與木瓜的總酚含量關(guān)系一致，木瓜水提物的總酚含量大于醇提物，酶解后的木瓜提取物總酚含量有所提高。說(shuō)明酚類(lèi)物質(zhì)的含量與木瓜的抗氧化活性成正比。

參考文獻
［1］ 中國衛生部藥典委員會(huì )中國藥典一部廣州：廣東科技出版社，1995:46
［2］ Thomas, M, Cr!epeau, M J C., Rumpunen, K., & Thibault, J.F. 2000. Dietary fibre and cellwall polysaccharides in the fruits of Japanese quince (Chaenomeles japonica)［J］. LebensmittelWissenschaftundTechnologie 33: 124-131.
［3］ J.M. Ros, J. Laencina, P. 2003. Characterization of juice in fruits of different Chaenomeles species［J］. Swiss Society of Food Science and Technology 37: 301-307.
［4］ Hamauzu Y, Y. H., Inno T, Kume C, Omanyuda M. 2005. Phenolic profile, antioxidant property, and antiinfluenza viral activity of Chinese quince (Pseudocydonia sinensis Schneid.), quince (Cydonia oblonga Mill.), and apple (Malus domestica Mill.) fruits［J］. J Agric Food Chem. 53(4): 7.
［5］ Singleton, V. L., & Rossi, J. A. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents［J］. American Journal of Enology and Viticulture 16: 144-158.
［6］ R. Juriic＇〖〗 Grubeic＇〖〗, J Vukovic＇〖〗, D Kremer and S Vladimir-Kneevic＇〖〗. 2005. Spectrophotometric method for polyphenols analysis: Prevalidation and application on Plantago L. species［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39: 837－842.
［7］ E.Hagerman, A. Tannin Handbook.1998:116.