摘要：目的觀(guān)察紫菜多糖對正常小鼠免疫功能的影響。方法分別經(jīng)口給予實(shí)驗小鼠500、1000、2000mg／kg BW三個(gè)劑量的紫菜多糖。30天后，測定小鼠臟器／體重比值、細胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細胞功能、NK細胞活性和白介素-2的值。結果各劑量組對小鼠胸腺／體重比值、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力、小鼠NK細胞活力和小鼠血清溶血素水平均無(wú)影響；500和2000mg／kg BW劑量組能升高小鼠脾／體重比值；2000mg／kg BW劑量組的紫菜多糖能明顯增強DNFB誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應、增強ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力、能促進(jìn)抗體生成細胞的生成，并能促進(jìn)體液細胞白介素2數值的增加；1000、2000mg／kg BW劑量組使碳廓清能力增強。結論紫菜多糖具有增強小鼠免疫功能作用。
關(guān)鍵詞：紫菜多糖；免疫調節

The Study of Porphyra Polysaccharide Sulfate(PPS) on
Regulating the Immune Function in Mice
Zhang Xunjie1，3Chen Guanmin2Chen lun2
1Fujian Hwanan women college, Fuzhou 350007
2Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350004
3Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

Abstract: ObjectiveTo observe the immune regulating effect of PPS in normal mice. MethodsThe mice were feed with PPS respectively at different concentration 500,1000 and 2000 mg／kg.d for 30 days. Mouse internal organs／body weight ratio, cellular immunity function, body fluid immunity function, single nucleus macrophage function, NK cell activeness and Bai Jiesu -2 value were detected. ResultsThere were no remarkably effects in mouse chest gland／body weight ratio, phagocytic function of peritomeal macrophage, NK cell activeness, andhemolysin production level. PPS can induce mouse spleen gland／body weight ratio at low and high dose. PPS can also promote DTH induced by DNFB, increase hemolysin production，enhance interferon2 （IL-2）and antibody formation cell production at high dose. PPS improve carbongranular clearance ability effectively at 1000、2000 mg／kg BW dose. ConclusionPPS( Porphyra polysaccharide sulfate) can enhance the immune function in mice.
Keywords: Porphyra polysaccharide sulfate (PPS); immunologicregulation.

我國海洋資源豐富，海藻品種繁多，為人們提供了食用、藥用和工業(yè)利用等多種產(chǎn)品。紫菜（Porphyra）是一種營(yíng)養價(jià)值較高的海藻，屬紅藻門(mén)(Rhodophyta)，紅毛菜科(Bangiacea)。海藻多糖物質(zhì)具有廣譜的免疫調節活性，并能通過(guò)免疫調節作用發(fā)揮多種生理活性［1］。紫菜多糖（Porphyra polysaccharide sulfate，PPS）是一種聚半乳糖的硫酸酯多糖［2］，是在糖羥基上帶有硫酸基的水溶性多糖，本文將重點(diǎn)探討紫菜多糖的免疫調節作用，合理地開(kāi)發(fā)我國紫菜的商業(yè)價(jià)值，使之獲得良好的經(jīng)濟、社會(huì )效益。
1 材料和方法
11 原料及試劑
紫菜為福建省連江市制碘廠(chǎng)提供的干燥壇紫菜。試劑為分析純或化學(xué)純。
12 紫菜多糖的制備
121 紫菜多糖樣品提取工藝流程
干燥紫菜→ 粉碎 → 浸泡 （ 除去色素和小分子物質(zhì)）→組織勻漿→熱水提取→過(guò)濾→ 乙醇沉淀→除蛋白質(zhì)→濃縮→凍干（得粗多糖）→純化→ 紫菜多糖樣品
122 預處理
取經(jīng)烘干、粉碎后的紫菜20g，置于250mL燒杯中；加20ml 60%丙酮浸泡、攪拌、靜置、抽真空過(guò)濾、棄去濾液；再用丙酮重復處理一次；用40ml95%乙醇回流1h，過(guò)濾，棄去濾液；用40ml無(wú)水乙醇回流提取半小時(shí)，過(guò)濾，棄去濾液；先用乙醇，再用丙酮，然后用乙醚洗滌，過(guò)濾，在空氣中干燥。這一過(guò)程可除去紫菜中的脂溶性組分。
123 提取
將預處理的紫菜，用蒸餾水浸泡、攪拌，靜置過(guò)夜，再經(jīng)組織搗碎；在80℃水浴浸提2h，離心，上清液抽濾，用旋轉薄膜蒸發(fā)器濃縮至適當體積，得紫菜多糖粗提液。用酒精使多糖脫水沉淀，靜置、離心，然后依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，用P2O5真空干燥，得灰白色纖維狀的紫菜多糖粗品。
13 實(shí)驗動(dòng)物
實(shí)驗動(dòng)物由中科院上海實(shí)驗動(dòng)物中心提供的清潔級BALB／c雌性小鼠，共200只，體重為18～21 g，合格證號為sCXK(滬)2003—003。動(dòng)物按體重隨機分成6大組,每大組再分成4組(20個(gè)小組)，分別為①體液免疫組：進(jìn)行溶血素、空斑測定；②細胞免疫組：進(jìn)行DTH試驗；③NK細胞活性組；④⑤單核- 巨噬細胞及臟體比組：進(jìn)行小鼠碳廓清試驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗及臟體指數測定；⑥白介素2組。
14 劑量選擇
試驗設紫菜多糖低、中、高劑量組，分別為500、1000、2000mg／kg BW三個(gè)劑量組及蒸餾水對照組。
15 給予受試物途徑
動(dòng)物按動(dòng)物按20ml／(kg BWd)連續灌胃30天，試驗期間，每周記錄動(dòng)物體重一次,分別進(jìn)行相關(guān)指標的測試。
16 儀器與試劑
161 儀器8mm直徑打孔器、微量血凝試驗板、UniverSal-32R臺式中低速離心機、MODEL680酶標儀、96孔培養板、Co－150CO2培養箱、200目篩網(wǎng)、722光柵分光光度計、Olympus IX71倒置顯微鏡、SRBC、雞紅細胞、Y -1細胞等。BonsoTes-2000A電子天平等。
162 試劑注射用印度墨汁、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、DNFB、丙酮、麻油、SRBC、生理鹽水、雞紅細胞、羊紅細胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1細胞、Hanks液(PH72～74)、RPMI1640完全培養液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)、NAD、TrisHC1緩沖液(PH82)、1％NP40、臺酚蘭、1mol／L鹽酸、酸性異丙醇等。
17 方法
171 小鼠臟器／體重比值(胸腺指數和脾指數)取小鼠40只，隨機分成4組，連續灌胃30d后，小鼠稱(chēng)重，頸椎脫臼處死小鼠，取出脾臟及胸腺，用濾紙吸干血跡后稱(chēng)重。
172 細胞免疫功能
1721 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實(shí)驗(MTT法) 無(wú)菌取脾制成單細胞懸液，每份細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1ml，一孔加75μlConA液，另一孔為對照，置培養箱中培養72 h。培養結束前4 h，每孔吸去上清液07ml，加入07ml不含小牛血清的RPMI 1640培養液，同時(shí)加入MTT 50μl／孔，繼續培養4 h。培養結束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板，每孔做3個(gè)平行孔，用酶標儀以570nm波長(cháng)測定光密度值。
1722 遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)檢測小鼠腹部皮膚用電動(dòng)剃毛刀進(jìn)行脫毛處理，后用DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏；5d后，再用DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊；24h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右兩耳，用打孔器取下直徑8mm的耳片稱(chēng)重，計算左右耳重量差值。
173 體液免疫功能小鼠腹腔注射2％(v／v)SRBC懸液02ml進(jìn)行免疫。5d后，取小鼠眼球血做血清溶血素檢測，并將動(dòng)物頸椎脫臼處死，取脾臟進(jìn)行抗體生成細胞檢測。
1731 抗體生成細胞檢測取出脾臟后，將脾細胞懸浮于8ml Hanks液中。將表層培養基加熱溶解后，放入45℃水浴保溫，與等量的PH72～74、2倍濃度的Hanks液混合，分裝小試管，每管05ml，再向管內加入50μl 10％SRBC、25μl脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂薄層的6cm平皿上，放入CO2培養箱中溫育15 h，然后用SA緩沖液稀釋的補體加入，繼續溫育15h后，計數溶血空斑數。
1732 血清溶血素測定(血凝法)將小鼠眼球血于2000 r／min離心10min分離血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋?zhuān)瑢⒉煌♂尪鹊难宸謩e置于微量血凝板內，每孔100μl，再加入100μl05％(v／v)的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤(pán)內加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀(guān)察血球凝集程度(用抗體積數表示)。
174 單核－巨噬細胞功能測定
1741 小鼠碳廓清實(shí)驗測定按10ml／kg從小鼠尾部靜脈注入稀釋的印度墨汁，注入墨汁后2、10min，分別從內眥靜脈叢取血20μl，并立即將其加到2ml 01％Na2CO3溶液中。用721分光光度計在600nm處測光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作為空白對照。將小鼠處死后解剖動(dòng)物，取出肝臟、脾臟，用濾紙吸干血跡后稱(chēng)重，計算吞噬指數a［吞噬指數a=體重／(肝重+脾重)×k1／3；k=(OD1—OD2)／(t2—t1)］。
1742 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實(shí)驗(半體內法)每鼠腹腔注射20％雞紅細胞懸液1ml。間隔30min，處死動(dòng)物，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml，轉動(dòng)鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，移置37℃孵箱溫育30min，用4％(v／v)Giemsa—磷酸緩沖液染色3min后計數，計算吞噬百分率［吞噬百分率(％)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數／計數的巨噬細胞數×100］和吞噬指數［吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數／計數的巨噬細胞數］。
175  NK細胞活性測定(LDH測定法)無(wú)菌取脾制成單細胞懸液，試驗前24h將靶細胞傳代培養。取靶細胞和效應細胞各100μl(效靶比為50∶1)，加入96孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100μl、靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1％NP40各100μl，上述各項均設三個(gè)平行孔，于37℃ 、5％CO2培養箱中培養4h，然后將培養板離心(1500r／min)5min，每孔吸取上清液100μl置于96孔培養板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μl，反應3min，每孔加入1mol／L的Hcl30μl，在酶標儀490nm處測定光密度值(OD)，計算NK細胞活性［NK細胞活性(％)=(反應孔OD—自然釋放孔OD)／(最大釋放孔OD—自然釋放孔OD)×100］。
176  白介素2測定 采用雙抗夾心ELISA法，用試劑盒測定吸光度OD值。
18 實(shí)驗數據統計方法實(shí)驗數據以SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2結果
21 紫菜多糖對正常小鼠臟器／體重比值的影響與對照組相比，紫菜多糖各劑量組脾重／體重比值差異有統計學(xué)意義，低劑量和高劑量組與對照組相比有顯著(zhù)差異（P＜0001）。與對照組相比，中劑量組1000mg／kg BW胸腺／體重比值上升差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞005）。結果見(jiàn)表1。胸腺指數各劑量組與對照組相比雖無(wú)統計學(xué)意義，但結果呈劑量關(guān)系。

22 紫菜多糖對正常小鼠細胞免疫功能的影響

221 紫菜多糖對ConA誘導的正常小鼠脾淋巴細胞轉化的影響紫菜多糖的高劑量組，2000mg／kg BW 劑量組的淋巴細胞增殖能力高于對照組，差異有統計學(xué)意義(P＜001)，并且有劑量效應關(guān)系。結果見(jiàn)表2。
222 紫菜多糖對正常小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應水平(DTH)的影響紫菜多糖的2000mg／kg BW劑量組對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應水平高于對照組，差異有統計學(xué)意義(P＜005)，并且有劑量效應關(guān)系。結果見(jiàn)表2。

23 紫菜多糖對正常小鼠體液免疫功能的
影響231 紫菜多糖對正常小鼠抗體生成細胞的影響紫菜多糖的低、中、高劑量組對小鼠抗體生成細胞的生成作用呈劑量-效應關(guān)系。高劑量組與對照組相比，差異有統計學(xué)意義(P＜001)，各劑量組對血清溶血素的影響，與對照組相比雖無(wú)統計學(xué)意義，結果見(jiàn)表3。

24 紫菜多糖對正常小鼠單核－巨噬細胞
功能的影響241紫菜多糖對正常小鼠碳廓清的影響與對照組相比，紫菜多糖各劑量組對小鼠碳廓清能力有顯著(zhù)差異，呈劑量效應關(guān)系，有統計學(xué)意義,高劑量組和中劑量組與對照組相比有顯著(zhù)差異(P＜0001,P＜001)。結果見(jiàn)表4。
242 紫菜多糖對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響與對照組相比，紫菜多糖各劑量組對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的增強,差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞005)。結果見(jiàn)表4。

25 紫菜多糖對正常小鼠NK細胞活性的
影響紫菜多糖的各劑量組小鼠NK細胞活性與對照組的差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞005)。結果見(jiàn)表5。
26 紫菜多糖對正常小鼠白介素2的影響
紫菜多糖的高劑量組,2000mg／kg BW對小鼠白介素2的OD值與對照組的差異有統計學(xué)意義(P＜001)。結果見(jiàn)表6。

3 討論
根據實(shí)驗結果，紫菜多糖2000mg／kg BW劑量組能明顯增強DNFB誘導的小鼠遲發(fā)變態(tài)型反應，且呈劑量效應關(guān)系；紫菜多糖的低、中、高劑量組對小鼠抗體生成細胞的生成作用呈劑量效應關(guān)系。2000mg／kg BW劑量組能明顯促進(jìn)抗體生成，及提高小鼠脾重／體重比值；2000mg／kg BW劑量組能使ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力明顯增強；1000、2000mg／kg BW劑量組使碳廓清能力增強；紫菜多糖的高劑量組,2000mg／kg BW使小鼠白介素2的含量顯著(zhù)提高，說(shuō)明紫菜多糖（PPS）對小鼠的細胞免疫、體液免疫均有增強作用。
多糖類(lèi)化合物是構成生物體的一類(lèi)十分重要的有機結構成分。是生命的物質(zhì)基礎。多糖的種類(lèi)各異。在生物體中行使著(zhù)不同的功能。主要影響機體的網(wǎng)狀內上皮系統和蛋白質(zhì)的合成及抗體的生成，含有激活淋巴細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞，具有促進(jìn)細胞因子的生成，改善機體的免疫功能的作用［3-4］ 。閆建忠等探討紫菜多糖對免疫功能低下小鼠的保護作用，利用小鼠腹腔注射不同劑量的紫菜多糖，發(fā)現紫菜多糖組小鼠的NK細胞毒活性、脾細胞分泌IFNγ及NO的水平均高于對照組，表明紫菜多糖具有免疫功能增強的作用［5］。同樣是閆建忠的另外一篇文獻報道：不含有3，6－內醚－半乳糖的硫酸基紫菜多糖不具有脾臟淋巴細胞、胸腺淋巴細胞以及混合淋巴細胞的增殖作用，提示：紫菜多糖中起到免疫調節作用可能與3，6－內醚－半乳糖硫酸基有關(guān)［6］。張偉云等采用細胞培養技術(shù)測定從條斑紫菜中得到的多糖PY3對小鼠免疫細胞及人腫瘤細胞K562生長(cháng)的影響。結果表明。紫菜多糖PY3對小鼠骨髓細胞和脾臟淋巴細胞、巨噬細胞的增殖以及對混合淋巴細胞反應均有促進(jìn)作用［7］。紫菜多糖的抑制癌癥的作用，與增強巨噬細胞的細胞毒活性有關(guān)，巨噬細胞表面有不同紫菜多糖分子受體，從而激化了巨噬細胞等免疫細胞。
結合上述實(shí)驗結果，可以推測紫菜多糖是通過(guò)3，6－內醚－半乳糖硫酸基，或者調控免疫細胞的產(chǎn)生和活力等方式在人體內發(fā)揮免疫協(xié)同作用，使其達到顯著(zhù)的增強免疫作用。醫學(xué)研究表明：機體組織細胞的凋亡、疾病的發(fā)生或多或少都與機體免疫系統的結構組成和免疫功能有關(guān)，如果正常機體的免疫系統不能對細胞的凋亡進(jìn)行調控，相應的組織器官就會(huì )發(fā)生病變，如腫瘤、艾滋病和乙肝等疾病也均為免疫系統受累導致免疫功能低下所致。所以，通過(guò)提高患者免疫功能來(lái)增強機體抗病力的治療方法受到了前所未有的關(guān)注。
本次研究已表明，紫菜多糖具有增強免疫調節的作用，可以針對不同人群開(kāi)發(fā)出相應的產(chǎn)品。對于免疫缺陷疾病患者可以作為輔助用藥，達到增強機體抗病能力以及愈后康復程度，縮短治療時(shí)長(cháng)的目的；對于免疫低下人群可以提高機體免疫力，預防和消除因免疫功能低下引起的各種疾病。另外，可以通過(guò)制劑學(xué)方向的研究，研究各種劑型，達到提高產(chǎn)品的人體生物利用度，增強其免疫調節的療效。
參考文獻
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