摘要: 目的研究番石榴葉水和乙醇提取物抗氧化活性,尋找高效天然抗氧化劑。方法干燥的番石榴葉分別用蒸餾水、650ml／L和950ml／L乙醇浸提，浸提液過(guò)濾、濃縮、干燥得到三種提取物。紫外分光光度法分析其中總黃酮含量，高效液相色譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜法對黃酮類(lèi)化合物初步鑒定；體外實(shí)驗測定各提取物對羥自由基清除和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性。結果提取液乙醇濃度升高，提取物中總黃酮含量增加。水和乙醇三種提取物均能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除羥自由基，并呈劑量效應關(guān)系；乙醇提取物抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和清除羥自由基作用強于水提取物。三種提取物抗氧化能力與其總黃酮含量有關(guān)。結論番石榴葉水和乙醇提取物均具有較強的抗氧化作用，其中黃酮類(lèi)化合物可能是影響抗氧化活性的主要因素。
關(guān)鍵詞：番石榴；植物化學(xué)物；抗氧化；黃酮類(lèi)化合物

現有研究表明許多植物化學(xué)物具有很強的抗氧化活性，在機體中可發(fā)揮抗衰老、抗腫瘤、抗炎、降血糖、抗心腦血管疾病等多種藥理學(xué)作用［1,2］。隨著(zhù)對氧自由基與疾病關(guān)系的理論研究不斷深入，抗氧化劑的應用價(jià)值日益得到重視，從天然植物中提取抗氧化活性物質(zhì)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
番石榴（Psidium guajava Linn.）屬于桃金娘科（Myrtaces），別名番稔、紅心果、雞屎（矢）果和番桃等，原產(chǎn)于美洲熱帶地區，世界熱帶與亞熱帶地區均有分布，生于曠野或村莊附近。我國主要分布于廣東、廣西、福建、江西、四川和臺灣等省、自治區，既有廣泛的人工栽培，也有大量野生種類(lèi)［3］。許多研究表明番石榴葉提取物可治療輪狀病毒腸炎、降血糖和局部止血等作用［4-6］。番石榴果具有較強的抗氧化作用［7］，但番石榴葉的抗氧化作用研究報道較少。本文對攀枝花地區野生番石榴葉的水和乙醇提取物的抗氧化活性及其有效成分進(jìn)行了初步的研究。
1 材料和方法
11 材料
111 主要試劑950ml／L食用乙醇（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)），蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所），SOD和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），過(guò)氧化氫（成都市方舟化學(xué)試劑廠(chǎng)）聚酰胺粉（江蘇臨江試劑化工廠(chǎng)），鄰二氮菲（浙江省溫州市東升化工試劑廠(chǎng)）。
112 主要儀器UV260型紫外可見(jiàn)分光光度計（日本島津）；WATERS1525型高效液相色譜儀（美國WATERS）,配有2996型二極管陣列檢測器（PAD,美國WATERS）；KQ250型超聲波清洗器（昆山市淀山湖檢測儀器廠(chǎng)）。
113 實(shí)驗動(dòng)物及飼養環(huán)境雄性昆明種小鼠，清潔級，體重18～22g，購于四川省醫學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心（合格證號：醫動(dòng)字第24101106號）。小鼠飼養于屏障級實(shí)驗動(dòng)物室（配備IVC獨立通氣飼養籠）。
114 番石榴葉攀枝花地區野生番石榴葉，12月份采摘。
12 方法
121 番石榴葉提取物的制備依據植物化學(xué)成分傳統提取方法［8］，選用不同溶劑浸提制備番石榴葉提取物。
番石榴葉采摘后立即用水清洗，通風(fēng)曬干、打碎，陰涼干燥處貯存。稱(chēng)取碎葉三份，分別用蒸餾水于60℃、650ml／L食用乙醇于60℃、950ml／L食用乙醇于38℃浸泡48h，浸液經(jīng)20層紗布過(guò)濾，濾液再經(jīng)G3玻砂漏斗抽濾；濾渣再同樣浸泡48h，提取濾液，反復兩次。合并三次濾液。
濾液60℃水浴蒸發(fā)濃縮，粘稠狀濃縮物于烘箱中60℃干燥；醇提的干燥提取物用乙醚脫脂。所得提取物研磨成粉末，即獲得水提物(WE)，650ml／L食用乙醇提取物(AE65)和950ml／L食用乙醇提取物(AE95)，裝于棕色瓶中，于干燥器中保存。
122 番石榴葉提取物中總黃酮含量測定
稱(chēng)取番石榴葉提取物約005g，用無(wú)水乙醇15ml超聲提取15 min。吸取提取夜10ml,聚酰胺吸附，苯洗脫雜質(zhì)，甲醇洗脫黃酮，定容至10ml。以無(wú)水乙醇作空白對照。分析液360nm波長(cháng)測吸光度。據蘆丁標準曲線(xiàn)回歸方程，計算樣品中總黃酮含量（以蘆丁計）［9］。每種提取物平行測三次，取三次測定值的均值。
123 番石榴葉提取物中黃酮類(lèi)化合物初步鑒定
參考張延之等測定黃酮方法［10］，稱(chēng)取適量番石榴葉提取物05g，加甲醇至10ml，超聲提取黃酮20min。提取液045μm濾膜過(guò)濾，濾液經(jīng)高效液相色譜柱分離后，對各分離組分在200～500nm范圍內進(jìn)行波長(cháng)掃描分析。以蘆丁作標準對照。
色譜條件：RPC18對稱(chēng)柱（5μm，39cm×150mm），流動(dòng)相為甲醇－水－冰乙酸（40:60:2），流速10ml／min，柱溫32℃。
124 番石榴葉提取物對羥自由基的影響
采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥自由基（HO·）（Fonton反應）方法［11］。取075mmol／L鄰二氮菲溶液1ml，PBS液2mL和蒸餾水1ml，充分混勻后，加075mmol／L硫酸亞鐵1ml，混勻，加001%的過(guò)氧化氫1ml，于37℃溫育60min，于536nm處測其吸光度，其值為AP。用1mL 30%的乙醇代替1mL過(guò)氧化氫，測得吸光度為AB。取不同濃度的提取物水溶液1ml代替1ml蒸餾水，測得吸光度為AS。按下式計算HO·清除率（d％）：
d%=AsAp〖〗ABAp×100%
125 番石榴葉提取物對脂質(zhì)過(guò)氧化的影響
按文獻方法［12］，取小鼠肝臟，生理鹽水洗除血污，剪碎用生理鹽水制成3％勻漿。取此勻漿03ml，加人不同濃度的提取物水溶液017ml、00024%過(guò)氧化氫01ml、003mmol／L硫酸亞鐵01ml，37℃保溫60min；然后加人20%三氯醋酸1ml及067% TBA 1ml,90℃保溫15min，流水冷卻，4000r／min離心20min，取上清液測定532nm測吸光度A。蒸餾水代替TBA作空白對照。按下式計算脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率（I％）：
I％= ［（A空白A藥液）／A空白］×100%
2 結果
21 番石榴葉提取物中總黃酮含量
水提取物中總黃酮含量比較低；乙醇濃度增高，乙醇提取物中總黃酮含量增高（見(jiàn)表1）。

22 番石榴葉提取物中黃酮類(lèi)化合物初步
鑒定高效液相色譜分析表明，水、650ml／L乙醇和950ml／L乙醇等三種提取物中含有四種相同組分（見(jiàn)圖1：峰1、2、3、4），其中峰1保留時(shí)間與蘆丁的保留時(shí)間相同。峰1、2、3和4分別在2556～2568nm和3554～3606nm間有最大吸收（見(jiàn)圖2：吸收曲線(xiàn)1、2、3、4），峰1、峰2和峰3與蘆丁的紫外可見(jiàn)吸收光譜的峰型、峰位和峰強度相似；而峰4的紫外可見(jiàn)吸收光譜的峰強度與峰1、2和3不同。該測定結果表明，番石榴提取物含有蘆丁等黃酮類(lèi)化合物。
23 番石榴葉提取物對羥自由基的清除能力
水、650ml／L乙醇和950ml／L乙醇提取物對反應體系中產(chǎn)生的羥自由基均具有一定清除作用，其清除效果隨著(zhù)濃度增加而增強，劑量效應關(guān)系呈直線(xiàn)型（見(jiàn)表2、表3）。羥自由基清除作用的半數有效濃度分別為063、047和058mg／L，乙醇提取物對羥自由基清除作用較大。

RT: 1 913； 2 1056； 3 1124； 4 1255
圖1番石榴葉提取物高效液相色譜圖
Fig1HPLC of the extracts from Psidium guajava leaves

注：1、2、3、4分別為圖1中相應高效液相色譜分離組分
圖2番石榴葉提取物高效液相色譜分離組分的紫外－可見(jiàn)光譜圖
Fig2UVabsorption of the separated component of extracts from Psidium guajava leaves by HPLC

24 番石榴葉提取物對脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制
作用水、650ml／L和950ml／L乙醇提取物對反應體系中脂質(zhì)過(guò)氧化具有一定抑制作用，抑制效果隨著(zhù)濃度增加而增強，劑量效應曲線(xiàn)符合一元二次方程模型（見(jiàn)表4、5）。脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用的半數有效濃度分別為020、0035和018g／L，乙醇提取物對脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用較大。

3 討論
黃酮類(lèi)化合物在240～400nm具有2個(gè)特征吸收帶，Ⅰ帶位于300～400nm之間，是由B環(huán)桂皮酰基體系的電子躍遷產(chǎn)生的吸收帶；Ⅱ帶位于240～285nm之間，是由A環(huán)的苯甲酰基體系的電子躍遷產(chǎn)生的吸收帶［13］，不同類(lèi)型的黃酮Ⅰ帶和Ⅱ帶的峰型、峰位和強度均有所不同，可以此初步判定黃酮類(lèi)化合物的類(lèi)型。本研究分析結果表明，番石榴葉提取物中有蘆丁；有兩種組分與蘆丁的紫外可見(jiàn)吸收光譜的特征吸收峰相似，Ⅰ帶最大吸收波長(cháng)在3554～3606nm之間，Ⅱ帶最大吸收波長(cháng)在2556～2568nm之間。而蘆丁的甙元是槲皮素，由此初步推測此兩種組分可能是以槲皮素為甙元的黃酮類(lèi)化合物。另有一種組分紫外可見(jiàn)吸收光譜具有黃酮類(lèi)化合物特征，但與前三種不同。以上初步鑒定結果還有待用紅外、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)一步確認。
大量研究表明，植物中黃酮類(lèi)化合物，如槲皮素、蘆丁、兒茶素等B環(huán)上有臨酚羥基的化合物具有較強的抗氧化活性［14,15］。本研究顯示隨著(zhù)提取液中乙醇濃度升高，提取物中總黃酮含量升高，所含黃酮類(lèi)化合物可能主要是蘆丁等以槲皮素為甙元的黃酮。體外實(shí)驗結果顯示，650ml／L和950ml／L乙醇提取物清除羥自由基能力和對脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力高于水提取物，并且隨劑量增加而增強。提取物成分分析顯示，番石榴葉乙醇提物總黃酮含量高于水提取物，而且黃酮類(lèi)化合物以蘆丁等槲皮素為甙元的黃酮為主，實(shí)驗結果提示黃酮類(lèi)化合物可能是主要的抗氧化活性成分。
影響抗氧化活性的物質(zhì)比較多。一般情況下，黃酮甙類(lèi)化合物的抗氧化活性低于相應的甙元［16］，微量元素既可以作為抗氧化的輔助因子發(fā)揮抗氧化作用［17］，也可以在一定條件下誘導過(guò)氧化反應［18］。比較清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力，650ml／L乙醇提取物半數有效濃度明顯低于水和950ml／L乙醇提取物，能在較小的濃度范圍內，作用效能迅速增強達到最大水平。結果提示650ml／L乙醇提取物中黃酮類(lèi)化合物不是唯一的有效成分，可能存在對抗氧化能力具有協(xié)同作用的其他成分。
體外試驗結果表明，番石榴葉是一種有效的天然抗氧化劑，乙醇提取物抗氧化能力較高，值得進(jìn)一步對番石榴葉提取物分離提純，從體外和體內等多方面對抗氧化作用機制進(jìn)行深入研究，分析功效成分及其相互作用規律，為番石榴葉資源的開(kāi)發(fā)和利用提供依據。
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