摘要：目的探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與高脂血癥的關(guān)系。方法選取北京市海淀區122名高脂血癥患者和90名血脂正常者分別作為病例組和對照組。對兩組人群均進(jìn)行血脂譜主要指標測定，并采用PCR-RFLP方法進(jìn)行MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性檢測。結果高脂血癥組和正常對照組T等位基因頻率分別為054和038，差異有顯著(zhù)性（P＜005）。CC、CT、TT三種基因型分布在兩組間的差異亦有顯著(zhù)性（P＜005）。按血清TC和TG水平將高脂血癥分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和混合型高脂血癥三個(gè)亞組后發(fā)現高膽固醇血癥組與對照組基因型分布和等位基因頻率仍具有顯著(zhù)性差異(P＜005)。結論提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性可能與高膽固醇血癥相關(guān)，T等位基因可能是高膽固醇血癥的危險因素。
關(guān)鍵詞：亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態(tài)性；高脂血癥

Relations between polymorphism of Methylenetetrahydrofolate
reductase gene polymorphism and hyperlipidemiaHuang LeiSong XiaomingZhu WenliLi Yong
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China

Abstract : Objective To investigate the relationship between this polymorphism and serum lipid levels in hyperlipidemic and normolipidemic individuals Methods A total of 122 unrelated hyperlipidemic individuals and 90 unrelated normolipidemic individuals were selected from Hai Dian District of Beijing For the two groups of subjects ,the serum lipids profiles were measured and the C677T polymorphism was analyzed (PCR RFLP)  ResultsThe frequencies of C allele in hyperlipidemic and control groups were 054 and 038 , respectively There was significant difference in genotype frequencies or allele frequencies of this polymorphism between hyperlipidemic and control groups When the hyperlipidemic subjects were divided into three subgroups (hypertriglyceridemic, hypercholesterolemic ,combined hyperlipidemic) according to lipid levels , there was still significant difference in genotype frequencies and allele frequencies of this polymorphism between hypercholesterolemic subgroup and control group ConclusionThe study indicated that C677T genotypes were possibly related with hypercholesterolemic subjects , T allele may be a new risk factor for hypercholesterolemia
Keywords: Methylenetetrahydrofolate reductase gene;Gene polymorphism; Hyperlipidemia

近年來(lái)大量的臨床及流行病學(xué)資料表明，高同型半胱氨酸血癥是導致動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的一個(gè)重要的危險因素。目前認為同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）主要通過(guò)促進(jìn)血管內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖、脂質(zhì)過(guò)氧化和血液凝固性增高等機制來(lái)誘導動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［1］。上述機制在心腦血管疾病中的作用以及是否還有其它機制尚需要進(jìn)一步的研究。然而，目前國內尚未見(jiàn)有關(guān)Hcy代謝關(guān)鍵酶與血脂水平關(guān)系的研究報道。為此，我們檢測了122名高脂血癥患者和90名健康人, 研究亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase ，MTHFR ）基因多態(tài)性與高脂血癥的相關(guān)性, 為探索Hcy致動(dòng)脈粥樣硬化機理提供依據。
1 對象與方法
11 研究對象經(jīng)北京大學(xué)醫學(xué)倫理委員會(huì )批準，在北京市海淀區花園路社區遵循自愿原則選取高脂血癥患者122例(總膽固醇TC≥572mmol／Ｌ或甘油三酯TG≥170ｍmol／Ｌ)，平均年齡為578±774歲，其中男性70人，女性52人。另選取正常血脂組90例(TC＜520mmol／L且TG＜170mmol／L)，平均年齡為561±893歲，男性57人，女性33人。排除有嚴重急慢性疾患如冠心病、腦卒中、糖尿病、腎功能不全及長(cháng)期服用影響脂質(zhì)代謝藥者。
12 血脂譜主要指標檢測采集清晨靜脈血5ml，取血清進(jìn)行血脂譜主要指標測定。血脂譜主要指標包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)。所用儀器為荷蘭VITALAB2型全自動(dòng)生化分析儀，用質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)量控制。
13 MTHFR基因C677T＞Ｃ位點(diǎn)多態(tài)性分析用酚－氯仿抽提法從血凝塊中提取基因組DNA。PCR 反應所用的引物序列［2］，正義5′TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA 3′，反義5’AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3′。PCR 反應體系(20μl )：051μg 基因組DNA、20μl 10×PCR反應緩沖液，12ul 25mmol／LMgcl2、05μl10 mmo l／L dNTP、01μl 50 mmo l／L 的引物、024μl 5U／μl Taq DNA 聚合酶。PCR 循環(huán)參數: 94℃ 30 s，62℃ 45s，72℃ 50 s，循環(huán)30周后于72℃延伸10 m in。循環(huán)條件: 預變性94 ℃2min、變性94 ℃30s、復性62 ℃30 s、延伸72 ℃45s ，循環(huán)30 次后72 ℃延伸7min。2 %瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察PCR 產(chǎn)物。取PCR 產(chǎn)物10μl， 加10×Buffer 20μl， 02μl 20U／μl Hinf I 酶，20μl 1mg／ml BSA ，補水至20μl ，37℃消化4h ，25%瓊脂糖膠電泳觀(guān)察結果。
14 資料整理與分析使用SPSS for windows110 統計軟件包進(jìn)行數據分析。各組基因型分布差異用χ2檢驗，不同基因型之間血脂水平的比較用ｔ檢驗。
2 實(shí)驗結果
21 高脂血癥組與對照組的臨床資料分析將高脂血癥組與對照組的臨床資料對比分析，結果見(jiàn)表1。高脂血癥組TC、TG、HDLC和LDLC顯著(zhù)高于對照組（P＜005），而性別構成兩組之間差異無(wú)顯著(zhù)性。

22 病例組與對照組父母MTHFR基因型分布及等位基因頻率比較MTHFR基因擴增目的片斷大小為198bp，根據HinfⅠ酶切片斷的情況MTHFR有3種基因型，即野生型CC，不被酶切，含有198bp１種片段，純合突變型TT，被酶切成175bp和23bp2種片段，雜合突變型TC，一條DNA被酶切，另一條未被酶切，含有198bp、175bp和23bp3種片段。高脂血癥組與對照組基因型和等位基因頻率分析，見(jiàn)表2。高脂血癥組基因型分布符合HardyWeinberg平衡規律（χ2 ＝0004，P＞005）。正常對照組基因型分布亦符合HardyWeinberg平衡規律（χ2 ＝0269，P＞005）。兩組基因型分布差異具有顯著(zhù)性（χ2 ＝10386，P＜005）。高脂血癥組C等位基因的頻率為046，T等位基因頻率為054，與正常對照組相比差異亦有顯著(zhù)性（χ2 ＝10529，P＜005)。與CC基因型相比，CC／CT基因型個(gè)體患高脂血癥的OR值為2462，95%可信區間為(1345，4506)。

23 不同類(lèi)型高脂血癥與對照組基因型分布和等位基因頻率比較按TC和TG水平將高脂血癥分為高膽固醇血癥(TC≥572mmol／L且TG＜170mmol／L)、高甘油三酯血癥(TC＜572mmol／L且TG≥170mmol／L)和混合型高脂血癥(TC≥572 mmol／L且TG≥170mmol／l)，分別比較不同類(lèi)型高脂血癥與對照組基因型分布的差異，見(jiàn)表3。高膽固醇血癥組基因型分布和等位基因頻率與對照組相比具有顯著(zhù)性差異（P＜005）；與CC基因型相比，CT／TT基因型患高膽固醇血癥的OR值為4400，95％可信區間為（1570，12335）。而另外兩組與對照組相比，基因型分布和等位基因頻率都無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞005）。

24 不同類(lèi)型高脂血癥組和對照組不同基因型間血脂水平的比較高膽固醇血癥組、高甘油三酯血癥組、混合型高脂血癥組和對照組中基因 C677T位點(diǎn)不同基因型的血脂水平見(jiàn)表4。各組不同基因型間血脂水平不具有顯著(zhù)性差異（P＞005）。

3  討論
MTHFR是Hcy代謝關(guān)鍵酶之一。該酶將5 ,10亞甲基四氫葉酸還原為甲基四氫葉酸，后者是Hcy再甲基化甲硫氨酸的甲基供體，MTHFR基因缺陷將會(huì )導致Hcy代謝障礙，形成高Hcy血癥。MTHFR 基因C677T突變是MTHFR最常見(jiàn)的一個(gè)突變，該突變可引起MTHFR酶耐熱性和活性下降，從而血中Hcy水平升高［3］。近年來(lái)，流行病研究顯示MTHFR基因C677T位點(diǎn)T等位基因變異可以使動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病患病危險性增加，但機理還未完全闡明。高脂血癥不但是一種嚴重危害人類(lèi)健康的疾病,而且還是冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管病的主要危險因素。目前有關(guān)MTHFR基因C677T位點(diǎn)變異和高脂血癥的關(guān)系的研究甚少，而且結果也不一致。H Yilmaz等［4］對29位腎移植病人的MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究表明：C等位基因對血脂水平有保護作用，而T等位基因具有危害作用；含有T等位基因變異的個(gè)體要比CC基因型的個(gè)體TC和LDLC都要高，而且具有顯著(zhù)性差異。而國外其它一些研究則未顯示MTHFR基因C677T位點(diǎn)變異對血脂水平有影響［5，6］。國內毛福梅等所做研究雖顯示TC、TG隨著(zhù)T等位基因頻率的升高有小幅度的提高，但這種差異不具有顯著(zhù)性［7］。
本次研究從遺傳變異的角度探討了中國人MTHFR基因C677T基因多態(tài)性與高脂血癥的關(guān)系。結果顯示高脂血癥組與對照組之間基因型分布和等位基因頻率差異有顯著(zhù)性(P＜005)。進(jìn)一步按血清TC和TG水平將高脂血癥分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和混合型高脂血癥三個(gè)亞組后再與正常對照組比較時(shí)，發(fā)現高膽固醇血癥組與對照組之間基因型分布和等位基因頻率差異仍具有顯著(zhù)性（P＜005）。與CC基因型相比，含有 T等位基因的個(gè)體患高膽固醇血癥患病危險性是它的44倍，提示T等位基因可能是高膽固醇血癥的一個(gè)危險因素。近些年來(lái)在動(dòng)物實(shí)驗、細胞培養以及人群流行病學(xué)研究中都曾發(fā)現血清Hcy與TC呈正相關(guān)［8，9］。Hcy可能會(huì )通過(guò)誘導內質(zhì)網(wǎng)應激，活化肝細胞、血管內皮細胞、動(dòng)脈平滑肌細胞中的未折疊蛋白反應及膽固醇調節元件結合蛋白，導致內源性固醇反應途徑失調［10］，因此推測MTHFR基因C677T多態(tài)性可能通過(guò)影響Hcy水平而影響血清總膽固醇的代謝。但比較各亞組血脂水平時(shí)，沒(méi)有發(fā)現高膽固醇血癥組不同基因型血脂水平差異有顯著(zhù)性（P＞005），這一結果可能與樣本量大小有關(guān)，需要在更大規模的人群中進(jìn)行驗證。此外，也有可能是血脂水平受遺傳和環(huán)境因素共同影響；或單一基因多態(tài)性位點(diǎn)的作用可能是“微效”的。因此在控制其它危險因素的條件下，進(jìn)行多基因多位點(diǎn)遺傳性狀的分析將是本研究下一步的工作重點(diǎn)。
綜上所述，本研究可初步得出以下結論:MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性可能與高膽固醇血癥密切相關(guān)，T等位基因可能是高膽固醇血癥的危險因素。
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