達能營(yíng)養中心在全球
青年科學(xué)工作者論壇2008年第2期
《衛生研究》--2008年第二期 中國發(fā)酵乳制品市場(chǎng)常用益生菌菌種的安全性評估
調查研究
中國發(fā)酵乳制品市場(chǎng)常用益生菌菌種的安全性評估
徐進(jìn) 嚴衛星 楊寶蘭 李志剛
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 10021
摘要：本文對中國2000年-2006年保健食品行業(yè)常用的137株益生菌菌種進(jìn)行了毒力試驗安全性評價(jià)，同時(shí)檢測了31株益生菌對20種抗生素的耐藥性，初步評估我國目前所使用的益生菌菌種安全性。結果表明：除一株鼠李糖乳桿菌外，其余益生菌菌種均為安全的。31株益生菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟；而對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥率較高。
關(guān)鍵詞：益生菌 耐藥性 安全性評估
中圖分類(lèi)號 ： 文獻標識碼：
Safety assessment of Probiotics in food as starters
XU Jin, YAN Weixing, YANG Baolan, LI Zhigang
National Institute of Nutrition and Food Safety, China Center for Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract: In this study, we analysised the safety of 137 strains of probiotics in food as starters in China between 2000 and 2006. The study was designed to evaluate the acute oral toxicity of 137 strains to mice, and 31 of 137 strains for Minimum inhibitory concentrations(MIC) of 20 kinds of antibiotics by broth micro-dilution method. The result suggests that except a strain of Lactobacillus rhamnosus , other probiotics are non-pathogenic and safe for human consumption. 31 strains of probiotics were sensitive to Ampicillin ,Penicillin ,Imipenem ,Gentamicine, Amoxicillin, Amoxicillin/clavulanic acid ,Gatifloxacin , Erythromycin , Clindamycin, and resistant to Nalidixic acid, Vancomycine , Fosfomycin.
Key words: Probiotics, Antibiotic Susceptibility Testing, safety assessment
2002年FAO/WHO(Food and Agriculture Organization /World Health Organization)聯(lián)合專(zhuān)家組提出了《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》 [1]，原則指出益生菌是指活的微生物，當人體攝入足夠量的時(shí)候可對人體產(chǎn)生有益的
作用。通常所說(shuō)的益生菌主要就是指乳桿菌和雙歧桿菌等乳酸菌，這些益生菌廣泛應用于發(fā)酵食品中，如酸奶、乳酪，或者將益生菌直接制成菌粉食用。
傳統的益生菌菌種，比如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在安全應用上已有很長(cháng)的歷史，被認為是沒(méi)有致病可能性的共生微生物體。但目前新的益生菌菌種不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)進(jìn)入市場(chǎng)，如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌也在我國發(fā)酵乳制品市場(chǎng)中應用。這些新菌種能否分享傳統菌種的安全性，目前引起國外專(zhuān)家的極大爭論。鑒于此，FAO／WHO在《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》中指出益生菌存在的可能危害包括：①益生菌進(jìn)入血液引起的人體全身性感染（菌血癥和感染性心內膜炎）；②益生菌產(chǎn)生有害的代謝活性產(chǎn)物對人體產(chǎn)生的不良反應；③食用益生菌制劑后對敏感個(gè)體的免疫刺激作用；④益生菌菌種在長(cháng)期使用后所攜帶耐藥基因的轉移。針對此安全問(wèn)題，本文對中國2000~2006年保健食品行業(yè)常用的137株益生菌菌種進(jìn)行了實(shí)驗動(dòng)物毒力試驗安全性評價(jià)，同時(shí)對31株益生菌進(jìn)行了耐藥性檢測，初步評估中國目前所使用的益生菌的菌種安全性。
1 材料
1.1材料
2000~2006年中國保健食品行業(yè)常用益生菌菌種，包括49株雙歧桿菌（Bifidobacterium），74株乳桿菌（Lactobacillus）和14株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），共計137株益生菌。
1.2培養基：MRS（Man Rogosa Sharpe）培養基(OXOID，英國)。
1.3使用的抗生素（OXOID，英國）種類(lèi)及濃度范圍見(jiàn)表1。
1.4選用中國醫學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物研究所繁殖的健康成年清潔級昆明小鼠(許可證編號為SCXK(京)2004-0001)。
表1 本實(shí)驗使用的抗生素及其濃度范圍
Table 1 Antibiotics used in this study
|
序號
|
抗生素名稱(chēng) |
中文
|
濃度(μg/ml)
|
|
1
|
Ampicillin
|
氨芐西林
|
0.016-256
|
|
2
|
Penicillin
|
青霉素
|
0.016-256
|
|
3
|
Imipenem
|
亞胺培南
|
0.016-256
|
|
4
|
Gentamicine
|
慶大霉素
|
0.016-256
|
|
5
|
Vancomycine
|
萬(wàn)古霉素
|
0.016-256
|
|
6
|
Erythromycin
|
紅霉素
|
0.016-256
|
|
7
|
Clindamycin
|
克林霉素
|
0.016-256
|
|
8
|
Trimethoprin/sulfamethoxazone
|
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑
|
0.002-32
|
|
9
|
Amoxicillin
|
阿莫西林
|
0.016-256
|
|
10
|
Amoxicillin/clavulanic acid
|
阿莫西林/棒酸
|
0.016-256
|
|
11
|
Gatifloxacin
|
加替沙星
|
0.016-256
|
|
12
|
Ciprofloxacin
|
環(huán)丙沙星
|
0.002-32
|
|
13
|
Chloramphenicol
|
氯霉素
|
0.016-256
|
|
14
|
Streptomyxine
|
鏈霉素
|
0.016-256
|
|
15
|
Tetracycline
|
四環(huán)素
|
0.016-256
|
|
16
|
Fosfomycin
|
磷霉素
|
0.016-256
|
|
17
|
Kanamycine
|
卡那霉素
|
0.016-256
|
|
18
|
Nalidixic acid
|
萘啶酮酸
|
0.016-256
|
|
19
|
Ceftriaxone
|
頭孢曲松
|
0.016-256
|
|
20
|
Cephalothin
|
頭孢噻吩
|
0.016-256
|
|
21
|
Cefepime
|
頭孢吡肟
|
0.016-256
|
|
22
|
Norfloxacine
|
諾氟沙星
|
0.016-256
|
|
23
|
Rifampin
|
利福平
|
0.016-256
|
|
24
|
Cefotaxime
|
頭孢噻肟
|
0.016-256
|
2 方法
2.1 實(shí)驗動(dòng)物經(jīng)口灌胃法毒力試驗
該方法為中國國家食品藥品監督管理局保健食品評審中心規定方法。益生菌菌種接種于MRS的液體培養基中，置（36±1）℃兼性厭氧培養（48±2）h后，作為培養物原液備用，取部分培養物原液常溫下濃縮5倍，作為培養物5倍濃縮液備用。小鼠80只，雌、雄各半。分別隨機分為4組，劑量組設置為：培養物原液組、培養基原液空白對照組、培養物5倍濃縮液組、培養基5倍濃縮液空白對照組。將受試物以20.0ml/kg bw的劑量給小鼠灌胃，連續灌胃3d，觀(guān)察7d，記錄實(shí)驗過(guò)程中小鼠的體重變化、中毒表現及死亡情況。
2.2實(shí)驗動(dòng)物腹腔注射法毒力試驗
該方法為國家食品藥品監督管理局保健食品評審中心規定方法。益生菌菌種接種于MRS固體培養基中，置（36±1）℃兼性厭氧培養（48±2）h后，刮取平板上的菌苔，用生理鹽水制成菌懸液，濃度調整5.0×109cfu/ml。小鼠40只，雌雄各半，分別為益生菌菌懸液組和生理鹽水對照組。每只小鼠一次性腹腔注射0.3ml菌懸液，連續觀(guān)察7d。觀(guān)察小鼠體重增長(cháng)及是否有毒性反應或死亡。
2.3益生菌菌種藥物敏感性試驗
采用CLSI推薦的96微孔肉湯稀釋法[2]。對9株雙歧桿菌（Bifidobacterium）和22株乳桿菌（Lactobacillus）進(jìn)行耐藥性檢測。質(zhì)控菌株為Streptococcus pneumoniae ATCC49619。
3 結果
3.1實(shí)驗動(dòng)物經(jīng)口灌胃法毒力試驗結果:
共對我國保健食品行業(yè)2000~2006年間共計137株益生菌進(jìn)行了經(jīng)口灌胃法毒力試驗，包括49株雙歧桿菌（Bifidobacterium），74株乳桿菌（Lactobacillus）和14株嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。結果表明: 這137株益生菌均未觀(guān)察到對小鼠有毒性反應或死亡,同時(shí)也不影響小鼠體重的正常增長(cháng)。
3.2實(shí)驗動(dòng)物腹腔注射法毒力試驗結果:
對雙歧桿菌BB-12 （B. lactis Bb-12）,羅伊氏乳桿菌（L. reuteri）鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus LR）和鼠李糖乳桿菌GG ATCC53103 (L. rhamnosus GG，LGG)4株益生菌除進(jìn)行了經(jīng)口灌胃法毒力試驗，還對其進(jìn)行腹腔注射法毒力試驗檢測。結果表明：雙歧桿菌BB-12 ,羅伊氏乳桿菌和1株鼠李糖乳桿菌均未觀(guān)察到對小鼠有毒性反應或死亡,同時(shí)也不影響小鼠體重的正常增長(cháng)。
另1株鼠李糖乳桿菌以5.0×109、5.0×108和5.0×107cfu/ml三組菌懸液分別每只小鼠一次性腹腔注射0.3ml菌懸液，與生理鹽水對照組相比: 5.0×108和5.0×107cfu/ml菌懸液組均未觀(guān)察到對小鼠有毒性反應或死亡,同時(shí)也不影響小鼠體重的正常增長(cháng)。5.0×109cfu/ml組在觀(guān)察第24h內，雌雄動(dòng)物均表現為精神不振、弓背和背毛豎起中毒癥狀；在第48h內，動(dòng)物開(kāi)始出現死亡，雄性小鼠死亡5只，雌性小鼠死亡6只，存活小鼠仍有中毒癥狀；在第72h內，雄性小鼠累計死亡8只，雌性小鼠全部死亡，累計10只，存活小鼠仍有中毒癥狀且持續到第4d，第5d中毒癥狀消失，存活至觀(guān)察期末。
3.3 藥物敏感性試驗結果
本試驗益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentrations , MIC）范圍及對抗生素的耐藥模式見(jiàn)表2。
表2 益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（MIC）范圍(μg/ml)
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of Probiotics to different antibiotics
|
抗生素
|
耐藥判定標準的MIC值
|
乳桿菌（22株）
|
|
雙歧桿菌 （9株）
|
||
|
MIC范圍
|
敏感率（%）
|
|
MIC范圍
|
敏感率（%）
|
||
|
氨芐西林
|
≥8 （3）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
青霉素
|
≥8 （3）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
亞胺培南
|
≥0.5 （3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
慶大霉素
|
≥16 （3）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林
|
≥8（2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林/棒酸
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
加替沙星
|
≥4 （2）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
紅霉素
|
≥8（3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.5-0.016
|
100.00
|
|
克林霉素
|
≥8 （2）
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
四環(huán)素
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
利福平
|
≥4 （2）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-2
|
100.00
|
|
頭孢噻肟
|
≥32 （2）
|
0.016-8
|
100.00
|
|
0.125-4
|
100.00
|
|
鏈霉素
|
≥16 （2）
|
0.016-16
|
95.45
|
|
0.016-8
|
100.00
|
|
頭孢噻吩
|
≥32 （1）
|
0.125-64
|
90.91
|
|
0.125-64
|
77.78
|
|
氯霉素
|
≥4 （2）
|
0.012-4
|
90.91
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
環(huán)丙沙星
|
≥4（1）
|
0.016-8
|
81.82
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
諾氟沙星
|
≥16 （2）
|
0.125-128
|
77.27
|
|
2-64
|
66.67
|
|
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑
|
≥4 （2）
|
0.016-32
|
72.27
|
|
0.016-32
|
66.67
|
|
卡那霉素
|
≥16 （2）
|
0.5-64
|
68.18
|
|
0.0312-64
|
88.89
|
|
頭孢曲松
|
≥32 （1）
|
0.0625-32
|
63.64
|
|
0.0312-16
|
100.00
|
|
頭孢吡肟
|
≥32 （1）
|
0.0312-128
|
54.55
|
|
0.016-32
|
100.00
|
|
磷霉素
|
≥32 （1）
|
0.125-256
|
31.82
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萬(wàn)古霉素
|
≥32 （3）
|
0.25-256
|
27.27
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萘啶酮酸
|
≥32（1）
|
128-256
|
0.00
|
|
1-256
|
33.33
|
注：（1） Scientific committee on animal nutrition (SCAN) [6]；
（2）本試驗判定標準[7,8]； （3）CLSI[2] ；
由表2可見(jiàn)，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜，但乳桿菌對本實(shí)驗所選用的抗生素的耐藥性要高于雙歧桿菌。22株乳桿菌和9株雙歧桿菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟，且最低抑菌濃度范圍均比較低。22株乳桿菌對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥性較高，分別為100%，72.63%和68.18%。
4 討論
本試驗評價(jià)的137株益生菌均為中國國家食品藥品監督管理局批準使用的益生菌菌種。鑒于有些新菌種使用歷史不長(cháng)， 2003年起對這些新菌種除了進(jìn)行實(shí)驗動(dòng)物經(jīng)口灌胃法毒力試驗外，還要進(jìn)行實(shí)驗動(dòng)物腹腔注射法毒力試驗，以進(jìn)一步深入評價(jià)這些菌種的安全性。以后的實(shí)踐也證明實(shí)驗動(dòng)物腹腔注射法毒力試驗是非常必要的，在對一株歐洲市場(chǎng)應用的鼠李糖乳桿菌進(jìn)入中國市場(chǎng)進(jìn)行安全性評價(jià)時(shí)，證明了該菌高濃度腹腔注射可導致實(shí)驗動(dòng)物死亡。
國際上也有報道鼠李糖乳桿菌可進(jìn)入人體形成菌血癥。芬蘭的國家疾病監測網(wǎng)在1990~2000年對全國520萬(wàn)人口中患菌血癥患者血培養物分析表明[3]，有66例患者的菌血癥是由益生菌引起的，其中48例為乳桿菌引起，益生菌引起菌血癥的發(fā)病率約為0.15~0.76/10萬(wàn)人。引起菌血癥的乳桿菌以鼠李糖乳桿菌為主，感染病例主要發(fā)生在免疫力低下（器官移植或癌癥）及年老體弱者。鑒于此，歐盟將鼠李糖乳桿菌列入監管使用的范疇。法國的資料顯示[4]，從1988~1990年內從血培養分離的微生物中乳桿菌平均為0.1%，明串珠菌為0.007%。Donohue等認為益生菌中大多數乳桿菌是安全的，而鏈球菌屬和腸球菌屬的某些菌株為條件致病菌[5]。
目前認為益生菌引起的感染多為二次感染。考慮到目前益生菌商品在貨架期內的活菌數一般為106cfu/ml-108cfu/ml，且通過(guò)口服進(jìn)入體內，要經(jīng)過(guò)胃液和膽汁酸的殺滅作用才能到達腸道，加之人體腸道粘膜還有屏障作用，因此在健康人群中不會(huì )有大量益生菌進(jìn)入血液，故鼠李糖乳桿菌對健康人群是安全的，但對免疫力低下和腸道粘膜有破損的人而言，考慮到個(gè)體的敏感性，應加強含鼠李糖乳桿菌商品的售后監測。
益生菌安全性另一個(gè)非常重要的方面是其耐藥性。本研究結果顯示，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜，乳桿菌耐藥性要高于雙歧桿菌。
以目前我國對益生菌的管理來(lái)看，本試驗評價(jià)的137株益生菌均為安全的，但應對含鼠李糖乳桿菌的商品進(jìn)行售后監測。我國目前對益生菌的安全性評價(jià)手段還與國際水平有一定差距，隨著(zhù)越來(lái)越多的國外益生菌新菌種申報進(jìn)入中國市場(chǎng)，國內益生菌市場(chǎng)的迅速增長(cháng)，也附帶了不安全性的風(fēng)險。因此，對我國發(fā)酵乳制品市場(chǎng)常用益生菌菌種安全性進(jìn)行風(fēng)險評估，建立適合我國國情的益生菌安全性評價(jià)體系，對保證我國發(fā)酵乳制品市場(chǎng)的安全性有重要的意義。
參考文獻
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