張蕊 張梅 秦學(xué)艷 趙文娟 賈麗紅^[1]

（中國醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院，沈陽(yáng)，110001）

 

摘要:目的觀(guān)察HQ對V79細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位的影響及LA的干預作用。方法在體外培養的V79細胞中分別加入不同濃度的LA和HQ，培養24h，采用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡分別檢測細胞線(xiàn)粒體膜電位變化。結果與對照組比較，50μM以上HQ可導致V79細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）；50μM和100μM LA對V79細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位沒(méi)影響，但能明顯拮抗50μM的HQ對細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位的影響（P＜0.05）。結論一定濃度LA具有明顯拮抗50μM HQ對V79細胞產(chǎn)生的毒性作用，其保護機制可能是通過(guò)線(xiàn)粒體途徑進(jìn)行的。

關(guān)鍵詞：硫辛酸(lipoic acid，LA)；氫醌(hydroquinone，HQ)；線(xiàn)粒體膜電位；JC-1(5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)；流式細胞術(shù)

 

線(xiàn)粒體是細胞內ATP的生產(chǎn)中心，在細胞凋亡、衰老、癌癥和信號轉導過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)發(fā)現許多危害人類(lèi)健康的疾病發(fā)生都與線(xiàn)粒體氧化損傷及其功能改變密切相關(guān)。線(xiàn)粒體功能受損的最早表現之一為線(xiàn)粒體膜電位的下降[1]。硫辛酸(Lipoic acid,LA)是目前受到關(guān)注的抗氧化劑之一，硫辛酸及其還原態(tài)二氫硫辛酸可以清除自由基和活性氧，螯合金屬離子，再生谷胱甘肽、維生素C和維生素E等，可改善葡萄糖代謝，降低氧化應激，對糖尿病性白內障、多發(fā)性神經(jīng)病及心血管損傷等糖尿病并發(fā)癥有較好的預防和治療作用，目前主要用于糖尿病人的輔助治療[2-3]，對于LA其他方面的抗氧化研究國內報道較少。氫醌(hydroquinone,HQ)是苯在體內的重要代謝產(chǎn)物，也是香煙煙霧和焦油中的主要成分之一，HQ在體內代謝過(guò)程中可產(chǎn)生大量自由基導致支氣管和肺的損傷，但目前確切機制尚不十分清楚。因此，本實(shí)驗采用MTT和JC1的方法，檢測HQ對體外培養的中國倉鼠肺纖維細胞(V79)的毒性作用，并重點(diǎn)研究HQ對線(xiàn)粒體膜電位的影響，同時(shí)選擇硫辛酸作為抗氧化劑，進(jìn)行干預性研究，為進(jìn)一步研究與苯或吸煙有關(guān)的肺損傷發(fā)生機制，采取有效的預防與治療措施提供理論依據。

 

HQ(Sigma)，LA(Sigma)，DMEM高糖培養液(HyClone)，胎牛血清(天津灝洋生物制品科技公司)，胰蛋白酶EDTA(Sigma)，JC1(Molecular Probes)，MTT(華美公司)，V79中國倉鼠肺細胞(中國醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所細胞中心)。酶標儀：UV300，流式細胞儀：FACS Calibur(美國B(niǎo)ecton Dickinson公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71)。

LA和HQ分別溶于PBS中，LA配成儲備液，保存在4℃冰箱中，HQ于每次實(shí)驗使用前現配制。JC1用二甲基亞砜(DMSO)溶解，濃度為1mg/ml，低溫貯存備用。

V79細胞用細胞培養液(DMEM培養液含10%胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/ml鏈霉素)按105/ml的細胞密度接種到96孔板、6孔板和培養瓶，置37℃，5%CO2培養箱中，每2天換液一次。待細胞達到生長(cháng)空間的80%-90%時(shí)，換成含1%胎牛血清的培養液，并分組施加以下處理因素：①對照組。②HQ組：HQ終濃度為0、10、20、30、40、50、100、150(μM)。③LA組：LA終濃度為0、50、100、200(μM)。④LA+HQ組1：LA終濃度為0、50、100(μM)；HQ終濃度為50μmol/。⑤LA+HQ組2：LA濃度同④組，HQ終濃度為100μM。培養時(shí)間均24小時(shí)。每個(gè)濃度組均設6個(gè)平行樣，且每個(gè)實(shí)驗至少重復2-3次。

實(shí)驗結束后，96孔培養板每孔加入20μl的MTT(終濃度為0.5mg/ml)，37℃培養4小時(shí)后，將各孔中液體吸棄，每孔加入200μl的DMSO，作用10分鐘，餛均后用酶標儀在540nm處讀取吸光度值A540nm。記錄每個(gè)實(shí)驗組的吸光度值，以細胞存活率表示：細胞存活率=實(shí)驗組A540nm/對照組A540nm。

實(shí)驗結束后，用37℃預熱的完全培養液與JC1充分混合后(JC1終濃度為2.0μg/mL)加入到培養瓶中，37℃下避光染色30分鐘，然后用PBS沖洗2次，離心后制成單細胞懸液，用流式細胞儀分別在485nm激發(fā)光和527nm、590nm發(fā)射光下測定紅、綠色熒光強度，以紅/綠熒光比值代表細胞線(xiàn)粒體膜電位；圖像的分析采用Cell Quest軟件，同時(shí)在倒置熒光顯微鏡下照像。

采用SPSS11.5統計軟件中單因素方差分析處理，數據用x-±s表示，P＜0.05為差異有統計學(xué)意義。

 

圖1顯示，與對照組比較，當HQ為40μM以上時(shí)，V79細胞存活率明顯下降，差異有統計學(xué)意義(P＜0.05)；并且HQ在40μM-150μM范圍內，隨著(zhù)HQ濃度增高，V79細胞存活率下降，呈劑量-效應關(guān)系。

 

圖1不同濃度HQ對V79細胞存活率的比較(x-±s，n=6)，與對照組相比，** P＜0.01

 

圖2顯示，與對照組比較，LA為50μM和100μM時(shí)，對細胞存活率沒(méi)有影響，但此濃度下的LA可以明顯拮抗50μM和100μM HQ所引起的V79細胞存活率的下降，差異有統計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2不同濃度LA對HQ作用下的V79細胞存活率的比較(x-±s，n=6)，與對照組相比，* P＜0.05,** P＜0.01;與HQ50（HQ100）組相比，^  P＜0.05; ^^ P＜0.05

 

圖3顯示，與對照組比較，50μM和100μM的HQ能使V79細胞線(xiàn)粒體膜電位明顯降低；50μM LA對細胞線(xiàn)粒體膜電位沒(méi)有影響。與單純HQ組比較，50μM的LA能明顯拮抗50μM和100μM的HQ對V79細胞線(xiàn)粒體膜電位造成的損傷作用。

圖3LA對50和100μM的HQ所致V79細胞線(xiàn)粒體膜電位影響的干預作用

 

 

圖4顯示，正常V79細胞線(xiàn)粒體維持較高的膜電位，JC1在線(xiàn)粒體內形成聚合物，以紅色熒光為主。50μM HQ可導致線(xiàn)粒體膜電位下降，JC1聚合物分解成單體，紅色熒光強度減弱。LA單獨作用時(shí)不改變線(xiàn)粒體膜電位，與HQ共同培養時(shí)可以拮抗HQ引起的線(xiàn)粒體膜電位下降。

 

 

 

圖4倒置熒光顯微鏡結果

 

眾所周知，吸煙能增加人類(lèi)許多慢性疾病發(fā)生的危險性，尤其對肺組織的損傷作用更加明顯。吸煙除了人們公認的尼古丁造成的危害之外，在吸煙的氣相和焦油中還存在著(zhù)大量對人體有害的自由基。有報道香煙的主流煙霧中HQ含量約為110～300μg/支[5]，它代謝產(chǎn)生的醌類(lèi)自由基(Q·/QH·)大約占香煙煙霧和焦油中自由基的85%[6]，同時(shí)釋放大量ROS，如超氧陰離子(O-2·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·)和單線(xiàn)態(tài)氧(O)等[7]。目前許多研究表明，線(xiàn)粒體氧化損傷與許多疾病的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗結果顯示：50μM和100μM的HQ能引起V79細胞存活率明顯降低，細胞線(xiàn)粒體膜電位明顯下降。熒光顯微鏡結果也顯示，50、100μM的HQ作用于V79細胞時(shí)，JC1發(fā)出紅色熒光的強度顯著(zhù)低于正常對照組，說(shuō)明HQ能造成V79細胞線(xiàn)粒體膜電位的明顯下降。JC1是一種廣泛用于檢測線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體膜電位。在線(xiàn)粒體膜電位較高時(shí)，JC1聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；在線(xiàn)粒體膜電位較低時(shí)，JC1不能聚集在線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC1為單體產(chǎn)生綠色熒光。因此通過(guò)觀(guān)察熒光顏色的轉變來(lái)檢測線(xiàn)粒體膜電位的變化。線(xiàn)粒體膜電位降低是線(xiàn)粒體功能障礙的標志之一，也是細胞凋亡的早期信號[8]；提示HQ導致V79細胞毒性作用可能是通過(guò)線(xiàn)粒體損傷途徑進(jìn)行的。

硫辛酸是一種重要的抗氧化劑，有研究指出其抗氧化性比維生素C和維生素E要強很多倍。LA在體內腸道吸收后進(jìn)入細胞,兼具脂溶性與水溶性的特性,因此可以到達任何一個(gè)細胞部位,提供人體全面抗氧化作用。LA可清除羥自由基(HO·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、單線(xiàn)態(tài)氧(O)、一氧化氮自由基(NO)等。因此，目前有關(guān)其抗氧化作用是研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗結果顯示，50、100μM的LA對V79細胞存活率和線(xiàn)粒體膜電位均沒(méi)有產(chǎn)生任何影響，但對50μM和100μM的HQ造成的V79細胞線(xiàn)粒體損傷有明顯的保護作用。國外有研究報道，50μM，100μM，200μM硫辛酸能拮抗丙二醛對人或大鼠視網(wǎng)膜上皮細胞造成的氧化損傷作用[4]。LA對老齡大鼠具有抗衰老作用[9]，對肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型的影響[10]，對大鼠全腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用[11]。因此本實(shí)驗提示：LA拮抗HQ對V79細胞產(chǎn)生的毒性作用機制可能與其拮抗HQ對V79細胞線(xiàn)粒體造成的損傷作用有關(guān)。

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