葛聲¹ 鄺勝利¹ 蔡東聯(lián)²

 

(1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫院營(yíng)養科，上海,200233；2.第二軍醫大學(xué)附屬長(cháng)海醫院，200433)

 

摘要:目的研究β-葡聚糖對CCl4誘導的大鼠肝纖維化組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達的影響，及其對信號傳導分子smad3 mRNA、smad7 mRNA表達的調控。方法80只雄性SD大鼠，70只腹腔注射40% CCl4油溶液制作肝纖維化模型，10只正常對照。8w后隨機處死3只肝纖維化模型組大鼠，經(jīng)肝組織HE染色證實(shí)肝纖維化形成。肝纖維化模型組大鼠隨機分為β葡聚糖治療組15只，以1ml/100g·BW的5% β葡聚糖生理鹽水溶液灌胃；秋水仙堿治療組用200ug/kg秋水仙堿生理鹽水溶液灌胃，陽(yáng)性對照組和正常對照組以10ml/kg生理鹽水灌胃。干預8w。組織學(xué)檢查觀(guān)察肝組織炎癥及纖維化程度，熒光定量PCR檢測肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及smad3、smad7 mRNA的表達。結果組織學(xué)檢查結果表明陽(yáng)性對照組肝臟纖維化程度明顯高于β葡聚糖組；熒光定量PCR檢測表明，陽(yáng)性對照組大鼠肝組織 Ⅰ、 Ⅲ型膠原mRNA相對表達量明顯高于正常組（p＜0.05）；β葡聚糖組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA相對表達量明顯低于陽(yáng)性對照，（p＜0.05）。陽(yáng)性對照組大鼠肝組織smad3 mRNA相對表達量明顯高于正常組（p＜0.05）；而smad7 mRNA相對表達量明顯低于正常組（p＜0.05），β葡聚糖組肝組織smad3 mRNA相對表達量低于陽(yáng)性對照組，而smad7 mRNA相對表達量高于陽(yáng)性對照組（p＜0.05）。結論口服β葡聚糖可減少CCl4誘導的SD雄性大鼠肝纖維化組織中膠原的表達，對肝纖維化有預防作用。其作用機制可能與調節smad3與smad7之間的失衡相關(guān)。

關(guān)鍵詞：β-葡聚糖；肝纖維化；Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA smad3 mRNA smad7 mRNA

β（1→3）（1→4）D-葡聚糖（β-葡聚糖）是一種非淀粉類(lèi)水溶性植物多糖,主要存在于大麥和燕麥麩皮中。其基本結構是D葡萄糖以β（1→3）（1→4）糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性多糖，是一種低聚糖，屬于可溶性膳食纖維。1997年，FDA指出每日飲食中含有3g以上β葡聚糖可降低血脂并能減少心血管疾病發(fā)生的危險[1]。實(shí)驗研究證實(shí)，葡聚糖具有保護受損肝細胞的作用[2]。但β葡聚糖是否具有防治肝纖維化的作用，至今未見(jiàn)報道。

本研究觀(guān)察了β葡聚糖對四氯化碳誘導SD雄性大鼠導致的肝纖維化的療效。采用熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）測定Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達，并對信號傳導分子smad3、smad7 mRNA表達的調控情況進(jìn)行了檢驗，探討β葡聚糖對實(shí)驗性肝纖維化的治療作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及造模處理

清潔級雄性健康SD大鼠80只，體重270±14g（220～285g）。購自上海西普爾-比凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司，許可證號：滬動(dòng)合格證字152號。

80只SD雄性大鼠，正常喂養1周后隨機分為2組：即正常對照組及肝纖維化模型組。模型組70只，腹腔注射CCl4造模，劑量：0.2ml/100g，2次/w，首次劑量未加倍。對照組10只，采用茶油腹腔注射，劑量同40% CCl4茶油溶液，每周2次。造模后第8w隨機抽取3只模型組大鼠，以氯胺酮腹腔注射麻醉后取門(mén)靜脈血5ml，分離血清，置-20℃保存待測；肝臟右葉相同部位肝組織經(jīng)蘇木精-伊紅染色，證實(shí)肝纖維化形成。造模過(guò)程中，模型組大鼠死亡22只。

 

1.2 干預實(shí)驗分組及方法

將肝纖維化大鼠45只，隨機分為陽(yáng)性對照組15只，秋水仙堿治療組15只，β葡聚糖治療組15只，正常對照組10只。實(shí)驗期間，β葡聚糖組每天用濃度為5%的β葡聚糖（江蘇無(wú)錫新光化工有限公司提供）生理鹽水溶液灌胃，劑量1ml/100g·BW；秋水仙堿組，用200ug/kg的秋水仙堿（西雙版納藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)品批號：國藥準字H53021369，0.25mg/片）生理鹽水溶液灌胃；陽(yáng)性對照組和空白對照組用生理鹽水灌胃，劑量10ml/kg。干預8w后所有大鼠氯胺酮麻醉后門(mén)靜脈采血，分離血清，-20℃保存待測，肝臟右葉相同部位取肝組織，一部分固定于10%中性甲醛中，一部分肝組織迅速置于液氮中保存。干預期間肝纖維化陽(yáng)性組大鼠死亡1只、秋水鮮堿組死亡4只、葡聚糖組死亡2只。

2觀(guān)察指標及測定方法

2.1 肝組織HE染色

右葉肝組織10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規HE染色。光鏡下觀(guān)察病理變化。按照中華醫學(xué)會(huì )傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì )及肝病學(xué)分會(huì )2002年9月聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》[3]中慢性肝炎纖維化分期標準，根據肝結構破壞范圍、程度和肝微循環(huán)影響的大小，分為1～4期（S1～4）。

2.2 肝組織膠原纖維染色

肝組織石蠟切片，常規脫蠟至水；Weigert蘇木素液染5~10min，自來(lái)水沖洗，0.5%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗，Van Gieson液染1~5min，95%乙醇分化脫水；無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固。光鏡下觀(guān)察。

2.3 血清轉氨酶檢測

Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平。

2.4 熒光定量PCR檢測肝組織內Ⅰ型、Ⅲ膠原mRNA以及smad3、smad7 mRNA的表達

熒光定量PCR檢測肝組織內Ⅰ型、Ⅲ膠原mRNA 以及smad3、smad7mRNA表達，設計合成Ⅰ型、Ⅲ型膠原及smad3、smad7的引物與探針，由廣州達輝生物科技有限公司設計合成。引物序列見(jiàn)表1。所有標本培養24h后，經(jīng)細胞mRNA抽提、逆轉錄cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測，反應體系：5×定量PCR反應緩沖液10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，dNTPs0.5μL，Tag酶2μL，cDNA模板5μL。熒光定量PCR反應條件：93℃ 2min；93℃ 45s，55℃ 1min，10個(gè)循環(huán)；93℃ 45s，55℃ 1min，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物分析：以βactin作為內參照，測定Ⅰ型、Ⅲ膠原及smad3、smad7的相對表達量。每個(gè)樣本的Ⅰ型、Ⅲ型膠原的相對mRNA表達水平能直接用樣品各自得內源控制物βaction（管家基因）表達標準化加入的初始RNA量。每個(gè)樣品中靶基因Ⅰ型、Ⅲ型膠原、samd3、smad7的相對mRNA表達水平采用以下公式進(jìn)行計算：相對mRNA表達=2-ΔCt。其中ΔCt值=靶基因Ct值-管家基因βaction Ct值。

 

表1引物序列

2.5 數據分析

數據用儀器自帶軟件：ABI Prism 7300 SDS Software進(jìn)行分析。

2.6 統計學(xué)處理

計量資料以x-±s表示，多組間均數用LSD單因素方差分析兩兩比較，計數資料采用x2檢驗。SPSS10.0軟件包進(jìn)行統計分析。

3結果

3.1 肝臟標本病理改變

正常對照組大鼠肝臟，顏色深紅，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地較軟；脾臟暗紅，質(zhì)軟。肝纖維化組大鼠肝臟增大，顏色淺，邊緣鈍，質(zhì)地硬，表面有粗顆粒狀表現，與周?chē)鞴僬尺B廣泛。

肝組織HE染色見(jiàn)正常組肝組織肝索結構清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝組織內無(wú)脂肪空泡。肝小葉結構完好，肝細胞排列無(wú)異常，少數肝細胞脂肪變性，纖維組織無(wú)明顯增生；肝纖維化大鼠門(mén)靜脈增粗，脾臟明顯腫大，呈暗紅色，肝細胞腫脹，肝組織內彌漫性水樣變性和脂肪變性，肝竇及中央靜脈明顯擴張，肝索排列紊亂，門(mén)管區及肝小葉內可見(jiàn)明顯的灶性淋巴細胞浸潤，間質(zhì)細胞大量彌漫性增生，形成細胞纖維間隔或纖維細胞間隔，分隔包繞肝細胞，有假小葉形成；β葡聚糖組及秋水仙堿組肝細胞壞死較輕，灶性炎細胞浸潤，可見(jiàn)再生肝細胞匯管區纖維組織增生，部分肝組織有假小葉形成，見(jiàn)圖1。膠原纖維染色可見(jiàn)各組肝臟纖維增生的情況，見(jiàn)圖2。

 

圖1各組大鼠肝組織的病理檢查

（HE染色×200）

 

Pathological analysis of SD rats liver tissue

(HE ×200）

A: Control group

B: Hepatic group

C: Colchicine treatment group

D: βglucan treatment group

 

圖2各組大鼠肝組織的膠原特染檢查

Pathological analysis of SD rats liver tissue(Van Gieson,×100）

A: Control groupB: Hepatic groupC: Colchicine treatment groupD: β-glucan treatment group

 

3.2 血清轉氨酶水平

陽(yáng)性對照組大鼠血清ALT、AST均較正常對照組升高（P＜0.05）；秋水仙堿治療組及β葡聚糖治療組均較陽(yáng)性對照組下降（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 大鼠肝纖維化分級的變化

肝纖維化分期顯示，與正常對照組相比，肝纖維化陽(yáng)性組、β葡聚糖組與肝纖維化陽(yáng)性對照組纖維化程度明顯增高，差異有統計學(xué)意義（p＜0.05）；與肝纖維化陽(yáng)性對照組相比，β葡聚糖組與秋水仙堿組肝纖維化程度均明顯減輕，差異有統計學(xué)意義（p＜0.05）。說(shuō)明β葡聚糖對肝纖維化大鼠具有治療作用。各組大鼠肝纖維化分期情況見(jiàn)表3。

 

表2各組大鼠血清轉氨酶水平比較

表3各組大鼠肝纖維化分期

 

3.4 大鼠肝組織內Ⅰ型、Ⅲ膠原mRNA以及smad3、smad7mRNA相對表達量

與正常對照組比較，肝纖維化陽(yáng)性大鼠肝臟Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA以及smad3 mRNA相對于其管家基因βactin表達量明顯升高，smad7 mRNA則明顯下降；相對于肝纖維化陽(yáng)性對照組，β葡聚糖組大鼠肝臟Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA以及smad3 mRNA相對于其管家基因βactin表達量明顯下降，smad7 mRNA則明顯升高（p＜0.05），見(jiàn)表4。

 

表4各組大鼠肝組織Ⅰ型、Ⅲ膠原mRNA以及smad3、smad7 mRNA相對表達量

4

討論

β-葡聚糖是禾谷類(lèi)植物籽粒胚乳和糊粉層細胞壁的主要成分[4]，在燕麥胚乳和糊粉層細胞壁成分中占85%以上。β-葡聚糖具有黏度高，在一定條件下具有凝膠性[5]和乳化穩定性[6]的特點(diǎn)。β葡聚糖對人體具有重要的生理調節功能。研究顯示，其能夠有效降低高膽固醇血癥患者血液膽固醇水平[7]、調節糖尿病患者血糖及糖代謝[8]以及增強免疫功能的作用。本實(shí)驗采用 CCl4腹腔注射造成SD雄性大鼠肝纖維化模型之后，給予大鼠β葡聚糖灌胃，經(jīng)肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現肝纖維化分級和膠原纖維沉積均較未施予任何治療措施的肝纖維化陽(yáng)性對照組大鼠明顯減輕（p＜0.05），提示β葡聚糖對CC14所誘導的大鼠肝纖維化具有一定的治療作用。作者認為β葡聚糖對肝纖維化的防治機制可能與以下因素有關(guān)：

 

4.1 β-葡聚糖可以調整腸道菌群，促進(jìn)益生菌生長(cháng)[9]。肝硬化后腸系膜動(dòng)脈擴張、管壁通透性增加，腸道蠕動(dòng)功能減退，容易發(fā)生細菌過(guò)度生長(cháng)，導致內毒素血癥[10]。循環(huán)內毒素又可進(jìn)一步損傷腸粘膜屏障，導致細菌易位，形成惡性循環(huán)，加重肝損傷。β葡聚糖在腸道中可以發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為結腸細胞提供能量，促進(jìn)雙歧桿菌在腸道中定植，抑制大腸桿菌的生長(cháng)，修復受損腸粘膜，保護其屏障功能[11]，從而減輕毒素入血后對肝臟的損傷。

4.2 β-葡聚糖具有免疫調節作用。燕麥β葡聚糖可使小鼠淋巴細胞增殖，增強小鼠抵抗細菌侵襲的能力；可刺激小鼠腹膜巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF－α)和白介素-1及巨噬細胞p338d1的釋放[12]。灌胃或腸外注射β葡聚糖，小鼠血清免疫球蛋白數量明顯增加[13]。

4.3 β-葡聚糖下調Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA，減少膠原纖維的合成，而達到防治肝纖維化的作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究β葡聚糖對肝纖維化大鼠肝臟Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達影響的研究結果表明，肝纖維化時(shí)，實(shí)驗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達均明顯高于正常對照組。肝纖維化是肝臟細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的合成與降解失衡導致其過(guò)度沉積的結果[14]。ECM包括膠原、非膠原蛋白以及蛋白聚糖三大成分，目前已確定有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、ⅪⅤ、ⅩⅧ型7種肝內膠原。在纖維化早期，Ⅲ型膠原較多，纖維化晚期則表現為Ⅰ型膠原含量較多[15,16]。肝星狀細胞（HSC）是產(chǎn)生膠原的主要來(lái)源。正常情況下，HSC處于靜息狀態(tài)，肝臟受損后，HSC被激活轉化為成纖維樣細胞，其胞漿脂滴丟失、形態(tài)改變、表達平滑肌α肌動(dòng)蛋白和多種細胞因子及其受體，并大量增殖，合成以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主的多種ECM。β葡聚糖下調了Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA，從而減少膠原纖維的合成，達到防治肝纖維化的作用。

4.4 本次實(shí)驗提示β-葡聚糖通過(guò)調節TGF β-smads信號轉導系統發(fā)揮抗肝纖維化作用。β葡聚糖治療后，肝纖維化大鼠內smad7 mRNA表達豐富并接近正常組，而samd3 mRNA表達減少，說(shuō)明β-葡聚糖能抑制smad3 mRNA而明顯促進(jìn)smad7 mRNA的表達，后者負反饋調節TGFβ的胞內信號傳遞，阻止HSC的活化及信號放大，阻止TGF-β1刺激所致的HSC活化及膠原合成有關(guān)。TGFβ是目前已知的最重要的致肝纖維化的細胞因子之一，在肝臟中主要由肝星狀細胞、Kupffer細胞等多種細胞產(chǎn)生，能促進(jìn)HSC活化，并分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，抑制ECM降解，抑制肝細胞DNA合成因而抑制肝細胞再生[17]。TGF βsmad信號通路是肝纖維化時(shí)主要的信號轉導通路[18]，TGFβ1激活HSC的信息轉導經(jīng)過(guò)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體及其下游效應分子，即Smads蛋白家族，啟動(dòng)膠原基因表達[19]。Smads蛋白是TGFβ1超家族的信號在細胞內轉導的一組蛋白。其中，與受體結合的是Smad2、Smad3，具有抑制作用的是Smad6、Smad 7，阻斷或干擾該信號轉導通路有可能阻止肝纖維化進(jìn)程[20]。TGF與其受體結合后，使其下游信號通道蛋白smad2、3磷酸化，與smad4形成異源寡聚體復合物，該復合物轉移到胞核介導TGFβ的生物學(xué)效應[21]。抑制型smad6、smad7是細胞中TGFβ1型受體拮抗蛋白，阻止smad2、3磷酸化而阻斷TGFβ的信號轉導過(guò)程，在TGFβ信號轉導中構成負反饋調節環(huán)路[22]。

本研究結果初步揭示了β葡聚糖具有防治實(shí)驗動(dòng)物肝纖維化的作用，探討了其對在肝纖維化大鼠Ⅰ、Ⅲ膠原mRNA的調控作用以及對TGFSmad 信號通路的調控作用。為進(jìn)一步研究食物營(yíng)養因素在肝纖維化防治中的作用提供了實(shí)驗依據。

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