李增寧¹駱彬¹康為均²勉麗娜²胡環(huán)宇¹

(1.河北醫科大學(xué)第一醫院，河北，050031;2.河北醫科大學(xué)公衛學(xué)院，河北，050017)

 

摘要：目的建立一種準確、簡(jiǎn)便、快速的高效液相色譜法用于測定腸內制劑中谷氨酰胺（GLN）的含量。方法以鄰苯二甲醛作柱前衍生劑，反相C18柱為固定相，以10mmol/L磷酸鹽緩沖液（Ph6.85）：甲醇=50：50為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，在λ340nm處測定L谷氨酰胺的含量。結果在100—1500μmol/L范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.9995）。回收率為98.43%-101.26%。結論該方法簡(jiǎn)便、準確，適用于腸內制劑中谷氨酰胺含量的分析。

 

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；谷氨酰胺；腸內營(yíng)養劑

 

The determination of GLN in enteral nutrient by HPLC Li zengningLuo binKang weijunMian linaHu huanyu

 

(First hospital of Hebei Medical University)

 

Abstract：ObjectiveTo establish a new high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining the contents of LGLN in enteral nutrient. MethodsLGLN was derived with Ophthaldehyde(OPA) and eluted with 10mmol/L phosphate buffer (pH 6.85) containing methanol on reverse phase C18 column. The derivative was detected at 340nm. Resultscalibration curves of GLN was linear from 100 to 1500 μmol/L (r=0.9995), and the recovery ratio was 98.43%-101.26%.ConclusionThe method is simple, rapid and effective, which can be used for determining LGLN of enteral nutrient.

 

Keywords: HPLC; GLN; enteral nutrient

 

 

谷氨酰胺（glutamine,GLN）是一種十分重要的具有特殊營(yíng)養作用的條件性必需氨基酸[1]，谷氨酰胺是免疫細胞的營(yíng)養底物，研究表明補充外源性谷氨酰胺可以改善膿毒血癥病人免疫細胞；谷氨酞胺在增強免疫細胞功能的同時(shí)不會(huì )增加促炎因子的產(chǎn)生。另外，還能促進(jìn)肌肉蛋白的合成，改善氮平衡。對ICU病人應用谷氨酰胺的研究發(fā)現，使用谷氨酰胺的患者6個(gè)月存活率獲得顯著(zhù)改善，而對照組病人更多地死于真菌感染和多臟器功能衰竭[2]。因此，谷氨酰胺被廣泛用于腸道營(yíng)養劑中，成為腸道營(yíng)養劑中的重要成份。本文建立了一種更為簡(jiǎn)便、迅速、準確的高效液相色譜法測定腸道營(yíng)養劑中的GLN，通過(guò)幾種樣品中GLN含量的測定表明此種方法是準確、有效的。

 

1資料與方法

1.1 儀器

HITACHI高效液相色譜儀（日本），低速離心機，超聲清洗器。

1.2 試劑

（1）鄰苯二甲醛（OPA）（北京亞太精細化工公司，分析純）、二巰基乙醇（天津市光復精細化工研究所）；甲醇（美國honeywell international inc，色譜純），GLN標準品（由中國藥品生物制品檢定所提供）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸等均為分析純；實(shí)驗用水均為雙蒸水，其他所用試劑均為分析純。

（2）衍生劑配制，稱(chēng)取13.5mg OPA溶于1ml甲醇中混勻，然后加40mmol/L硼酸緩沖液（pH 9.5）9ml混勻后再加入0.2ml 2巰基乙醇混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.3 色譜條件

色譜柱SUNTEK，C18，250×4.6mm,5μm；流動(dòng)相：10mmol/L磷酸鹽緩沖液（Ph6.85）：甲醇=50：50，流速1.0ml/min；柱溫：室溫；紫外檢測波長(cháng)340nm；靈敏度0.08；進(jìn)樣量20μl；全程10分鐘。磷酸緩沖液經(jīng).45μm濾膜過(guò)濾。

1.4 樣品處理及衍生

1.4.1 樣品處理：粉末狀樣品處理方法是準確稱(chēng)取0.1g樣品，加入10ml 10mmol/L磷酸鹽緩沖液（Ph6.85），搖勻后超聲5分鐘，再以5000r/min速度離心10分鐘，將中層液用0.45μm濾膜過(guò)濾后立即衍生檢測或在-20℃冰箱保存；乳狀液體樣品的處理方法是準確吸取1ml樣品，加入9ml 10mmol/L磷酸鹽緩沖液（PH6.85），搖勻后超聲5分鐘，再以5000r/min速度離心10分鐘，用0.45μm濾膜過(guò)濾后立即衍生檢測或在-20℃冰箱保存。

1.4.2 衍生：準確吸取濾液20μl，加100μl OPA衍生劑，旋渦混勻器混勻，室溫下反應90秒，取20μl進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

 

2結果

2.1 定性

取20μl一定濃度的GLN標準品加100μl衍生劑衍生后進(jìn)樣檢測，見(jiàn)圖1；取20μl純水加100μl衍生劑混勻后進(jìn)樣檢測，見(jiàn)圖2；同時(shí)，取20μl GLN標準品加100μl 10mmol/L磷酸鹽緩沖液（PH6.85）混勻后進(jìn)樣檢測，見(jiàn)圖3。由圖2可知純衍生劑在340nm也有紫外吸收，并且出現三個(gè)峰；而圖1中，GLN標準品經(jīng)衍生后，圖中出現四個(gè)峰，其中保留時(shí)間與圖2中的保留時(shí)間不同的一個(gè)峰在3.636min；由圖3可知，GLN未經(jīng)衍生時(shí)在3.636min是沒(méi)有紫外吸收的，由此證明此峰是GLN標準品衍生后的峰。

2.2 標準曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

配制濃度范圍為100-1500μmol/L GLN系列標準溶液，按上述方法測定，外標法定量，其濃度與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好，工作曲線(xiàn)方程為：Y=2123.7607+18.26X，r=0.9995，檢測限是10nmol/L。

2.3 回收率與精密度測定

取一樣品進(jìn)樣檢測，然后分別加入三種已知濃度（高，中，低）的標準品進(jìn)樣檢測，計算回收率，回收率范圍在98.43%-101.26%之間；取同一樣品重復測定5次，計算變異系數為5.09%。

2.4 樣品測定

通過(guò)上述方法共測定了10種常用腸內營(yíng)養制劑及1種谷氨酰胺顆粒，樣品圖譜見(jiàn)圖4，其中有五種樣品未檢出GLN，其余樣品的含量分別為：930mg/100g；4658mg/100g；98.5g/100g；943mg/100g；2339mg/100g；1581mg/100g。

 

3討論

血漿中谷氨酞胺含量測定，有較多報道[3-4]，但對營(yíng)養成品制劑中Gln的報道不多，我國目前對谷氨酰胺含量測定為定氮法，但方法較費時(shí)費力，操作時(shí)需同時(shí)空白校正，且稍不謹慎易漏氣或接收體積不夠均可造成含量偏低。采用專(zhuān)用氨基酸分析儀進(jìn)行分析，但儀器昂貴，成本很高。本方法對制劑中Gln含量測定的準確度提高，有利于更好地監測相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量；保證準確給予有關(guān)患者足量Gln的供應。

 

參考文獻

[1] 蔣朱明，蔡威主編.臨床腸外與腸內營(yíng)養.第1版.北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2000，123-152.

[2] 危重病人危重病人營(yíng)養指導意見(jiàn)（2006）中華醫學(xué)會(huì )重癥醫學(xué)分會(huì ).中華實(shí)用外科雜志.2006年10月第26卷第10期,721-732.

[3] 董光龍，王為忠，尚剛偉，等.快速測定組織、血漿中谷氨酰胺及其臨床意義[J].腸外與腸內營(yíng)養，2000,7(2):93-96.

[4] 朱明煒，肖路延，劉蕾，等.谷氨酰胺顆粒劑在健康人體的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國臨床營(yíng)養雜志,2003,11(2):88-91.