朱航¹張守華²雷蕾¹羅海吉¹

（1．南方醫科大學(xué)公共衛生與熱帶醫學(xué)學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系，廣州，510515；
2．南方醫科大學(xué)南方醫院肝膽外科，廣州，510515）

摘要：目的探討不同劑量的右旋糖酐鐵對小鼠肝臟抗氧化水平和病理?yè)p傷的影響。方法將雌雄各半的昆明小鼠隨機分為4組，以不同濃度的右旋糖酐鐵隔日腹腔注射（IP），注射6周后，測定肝組織中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)的活性，測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性，并做肝臟病理組織學(xué)檢查。結果與正常對照組相比，肝組織中MDA的含量較對照組明顯升高(P＜0.001),SOD和GSHPX的活性則明顯下降(P＜0.001)。血清ALT、AST活性較對照組明顯升高(P＜0.001),且有劑量效應關(guān)系；而血清AKP、ACP活性較對照組則無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05)。病理組織學(xué)檢查，經(jīng)鐵染色后鏡下可見(jiàn)低劑量組有少量鐵均勻分布，中高劑量組則有大量鐵存在。結論過(guò)量的鐵可對肝臟造成嚴重的損害，且呈劑量依賴(lài)性，其機制可能與鐵在肝臟內代謝釋放出鐵離子，游離的鐵離子介導脂質(zhì)過(guò)氧化而造成肝臟損害有關(guān)。
關(guān)鍵詞：鐵；肝損傷；脂質(zhì)過(guò)氧化

Study of the Liver Damage Effect of Different Dosage of Iron Dextran
Zhu Hang1Zhang Shou Hua2Lei Lei1Luo Haiji1

(1.Department of Nutrition and Food Hygiene,Public Hygiene and Tropical Medicine School, 
Southern Medical 
University; Guangzhou 510515；
2.Departmen of Hepatobiliary，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515, China)

Abstract：ObjectTo stuty the level of mice liver antiooxyged and the degree of mice liver pathological damage through intraperitoneal injection 0f different dose of iron dextran. in mice．MethodMale and female mice were randomly divide into four groups and were ntraperitoneally injected with different doses of iron dexyran every the other day, for six weeks．The levels of MDA，SOD and GSHPX in the liver and the levels of ALT，AST，AKP and ACP in the bloodserums were measured．Pathohistology analysis of the liver was also performed．ResultComparing with the nomal group, the MDA level in the liver was significantly increased (P＜0.001), and the levels of SOD and GSHPX were dramatically decreased (P＜0.001)．There is no significant difference the levels of AKP and ACP between the normal group and the treated group．The pathohistology examination result showed that iron scatter in the lowdose treated group was more than that in the highdose group．Conclusion.Excess iron cause severe damage of the liver in a dose dependent manner． The  mechanism may be the ferrous which release from liver cause lipid peroxidation.
Keywords：iron; liver damage; lipid peroxidation 

口服鐵劑是治療缺鐵性貧血等鐵缺乏疾病的常用治療方法，對口服無(wú)效或缺鐵病人和懷孕婦女則需要注射鐵劑治療。臨床上右旋糖酐鐵是常用的注射用鐵劑。然而長(cháng)期注射會(huì )導致體內鐵儲留，形成慢性鐵過(guò)載現象[1]，使組織和血清中的鐵含量增加，引起器官的廣泛受損[2,3]，其中首先受損的器官是肝臟[4]。目前在全世界，鐵代謝疾病如血色素沉著(zhù)癥[5]是最普遍的鐵代謝遺傳性疾病之一，且此類(lèi)患者體內組織和血清中鐵含量的高低還沒(méi)有一個(gè)有效的措施進(jìn)行調控[6,7]，唯一的方法就是進(jìn)行定期的放血治療[8]。因此，增強對鐵毒性致病機制的了解，對于為此類(lèi)患者提供一個(gè)安全有效的治療措施至關(guān)重要。本實(shí)驗通過(guò)采用全價(jià)顆粒飼料(含鐵量為370mg/kg)，輔以定期、定量腹腔注射右旋糖酐鐵的方法建立了不同濃度鐵對小鼠造成肝臟損害的動(dòng)物模型[9]，并對此模型小鼠的各項指標等與正常小鼠進(jìn)行比較，從而說(shuō)明高鐵對對肝臟的毒性作用，并對其致毒機制做初步探討。

1 材料和方法
1.1 材料
實(shí)驗于2006年5月7日在南方醫科大學(xué)公共衛生與熱帶醫學(xué)學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系實(shí)驗室進(jìn)行。選擇昆明小鼠40只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由南方醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心提供(許可證號：2002-009 2004B023 2004A063)。隨機（雌雄分養，不分體重）分成4組：對照組（腹腔注射生理鹽水,0.8ml/次）10只，低劑量組（腹腔注射右旋糖酐鐵,6.25mg/ml，0.8ml/次）10只，中劑量組（腹腔注射右旋糖酐鐵，12.5mg/ml，0.8ml/次）10只，高劑量組（腹腔注射右旋糖酐鐵，25mg/ml，0.8ml/次）10只。全價(jià)顆粒飼料，含鐵量為370mg/kg，購自南方醫科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗中心。右旋糖酐鐵制劑，規格為2mL含50mg元素鐵，浙江瑞安市制藥廠(chǎng)出品，批準文號為國藥準字H33021758。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。721分光光度計（上海第三分析儀器有限公司生產(chǎn)）、低溫高速離心機（Bechman,MODEL AllegraTMX-22R,USA）、全自動(dòng)生化儀（奧林巴斯AU5400）。
1.2 方法 
1.2.1 將4組小鼠雌雄分養于塑料不銹鋼籠內，室內溫度（23±3）℃，自由進(jìn)食，喂以去離子水。各組以不同濃度（mg/ml）的右旋糖酐鐵隔日腹腔注射（IP），注射6周。觀(guān)察動(dòng)物的一般狀況。6周末，將所有動(dòng)物處死，解剖。測定肝組織中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)的活性，全自動(dòng)生化儀測定血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性；并做肝臟病理組織學(xué)檢查。
1.2.2 生化指標的測定①肝勻漿丙二醛（MDA）含量:采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；②肝勻漿超氧化物歧化酶（SOD）活性:采用黃嘌呤氧化酶法。③肝勻漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)的活性:采用二硫代雙乙硝基苯甲酸(DTNB)顯色法。④血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性：采用金氏比色法。
1.2.3 病理組織學(xué)檢查①肉眼觀(guān)察；②光鏡檢查（×100，×400）：常規切片，HE染色，觀(guān)察其病理形態(tài)學(xué)改變；③鐵染色分析：常規切片用Schmeltzer法進(jìn)行鐵染色，光鏡下（×100，×400）觀(guān)察鐵的分布情況。
1.2.4 統計學(xué)分析文中數據采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統計學(xué)處理，統計方法有單向方差分析，各組均數的多重比較等，結果用（x-±s）表示，以P＜0.05認為差異有統計學(xué)意義。

2結果
2.1 各組小鼠肝勻漿SOD、MDA、GSHPX
含量變化情況與正常對照組相比，肝組織中MDA的含量較對照組明顯升高(P＜0.001),SOD和GSHPX的活性則明顯下降(P＜0.001，表1)。
2.2 各組小鼠血清ALT、AST、AKP、ACP
活性變化情況
血清ALT、AST活性較對照組明顯升高(P＜0.001),且有劑量效應關(guān)系；而血清AKP、ACP活性較對照組則無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05，圖1)。
表1各組小鼠肝勻漿SOD、MDA、GSHPX含量


圖1各組小鼠血清ALT、AST、AKP、ACP活性變化情況
fig.1The condition of activity changes for each group of rats serum ALT、AST、AKP、ACP

2.3 各組小鼠肝臟病理組織學(xué)檢查
①對照組小鼠的肝臟肉眼觀(guān)察未見(jiàn)明顯的病理改變，光鏡下細胞排列整齊，細胞形態(tài)規則，切片經(jīng)Schmeltzer法染色后未見(jiàn)被染成藍色的鐵(圖1,圖5)；②低劑量組小鼠的肝臟有輕度增大，光鏡下可見(jiàn)各臟器的細胞邊界不清，排列紊亂，鐵染色后可見(jiàn)有點(diǎn)狀被染成藍色的鐵，分布均勻(圖2,圖6)；③中劑量組小鼠的肝臟可見(jiàn)輕度淤血，肝臟表面散在少量芝麻大小的黃色斑點(diǎn)；光鏡下可見(jiàn)各臟器的細胞核消失，鐵染色后，被染成藍色的鐵廣泛存在(圖3,圖7)；④高劑量組小鼠肝臟有明顯的淤血現象，整個(gè)肝臟呈黑色，脾臟也呈現鐵褐色，兩者的重量已達到體質(zhì)量的10%左右；高倍鏡下（×400）細胞出現壞死，匯管區有多處凝固性壞死灶，出現核固縮、溶解，大量細胞水樣變性；鐵染色可見(jiàn)普遍存在被染成藍色的鐵(圖4,圖8)。



3討論
 含鐵類(lèi)物質(zhì)引起的各種損害都與膜脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。鐵為過(guò)渡金屬元素，有兩種價(jià)態(tài)，鐵能夠通過(guò)改變價(jià)態(tài)而釋放和接收電子在許多反應中起著(zhù)傳遞電子的作用。鐵在脂質(zhì)過(guò)氧化中起著(zhù)非常重要的作用〔10,11]。MDA是一種生物毒性很強的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的代表產(chǎn)物，可間接反應出細胞受損傷的程度[12]。Afanasev IB[13]等用體外實(shí)驗的方法證明，當培養液中鐵的濃度升高時(shí)，培養液中MDA的含量迅速升高。本實(shí)驗高鐵小鼠血清中MDA的含量較對照組分別升高了約3至4倍。說(shuō)明右旋糖酐鐵釋放的鐵離子能介導膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。此外，機體內還存在對氧自由基的各級防御體系，其中SOD和GSHPx對機體的氧化與抗氧化平衡起著(zhù)重要的作用，機體內的自由基會(huì )消耗肝臟中的SOD和GSHPx，當機體脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高時(shí)，SOD和GSHPx的活性會(huì )發(fā)生改變。周炯亮[14]等報道當肝細胞內的MDA含量升高時(shí)，GSH的含量下降。本實(shí)驗組各組肝臟中MDA含量升高時(shí)，SOD和GSHPx的活性與正常組相比明顯降低。這與大多數學(xué)者關(guān)于MDA與SOD、GSHPx在含量和活性上相關(guān)聯(lián)的報道一致[15,16,17]，說(shuō)明由于脂質(zhì)過(guò)氧化作用消耗了大量的SOD和GSHPx，肝臟對自由基的清除能力下降，造成機體對自由基的防御體系被破壞。
肝細胞中內有許多與代謝有關(guān)的酶類(lèi)，當肝細胞膜受到損害時(shí)細胞內的酶會(huì )滲漏到血液中，其中ALT和AST是肝臟受損最靈敏的指標，RONALD[18]等用含二茂鐵的飼料喂食小鼠15周后,發(fā)現染毒組肝臟鐵含量升高時(shí),血清ALT活性較對照組升高了約4倍。VALERIO[19]等用含0.2%二茂鐵的食物喂食小鼠115d后也發(fā)現血清中ALT活性明顯升高。本實(shí)驗高劑量組動(dòng)物血清ALT活性與對照組相比升高了約7倍，說(shuō)明辛基二茂鐵對肝細胞膜的損傷較重，致使大量的ALT釋放到血清中。
小鼠各肝臟病理學(xué)檢查表明過(guò)多的鐵可以損傷細胞，使細胞排列紊亂、邊界不清，發(fā)生變性、壞死等病理改變。鐵染色分析結果顯示，實(shí)驗組各臟器內含鐵物質(zhì)增多，光鏡下可見(jiàn)染成藍色的鐵存在，且隨劑量的增加而分布廣泛。由于鐵在細胞、組織內沉積，作為一種刺激因子，直接或間接地影響組織細胞代謝，組織內炎癥改變十分明顯，外觀(guān)組織充血水腫，這與文獻報道的結果相一致[20]。
總之，過(guò)量的鐵在體內貯存可造成肝臟的廣泛損傷，其作用機制可能與釋放出的鐵離子所誘導的膜脂質(zhì)過(guò)氧化等有關(guān)，確切機制還有待于進(jìn)一步研究。

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