張文青 張月明¹

（山西醫科大學(xué)第二醫院，太原，030001；1新疆醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院，烏魯木齊，830054）


摘要：目的研究抗性淀粉（RS）對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的干預作用。方法將40只Wistar大鼠隨機選取10只飼以基礎飼料（正常對照組），其余30只食用紅花油高脂飼料并進(jìn)行腹腔鏈脲霉素（STZ）注射（模型組）。對誘導成2型糖尿病的大鼠隨機分為三組，分別飼食高脂飼料（B組）、高脂RS飼料（C組）、單純RS飼料（D組）；原基礎飼料組為A組。繼續喂養5周，觀(guān)察RS對大鼠糖脂代謝、胰島素敏感指數影響及肝、腎組織病理學(xué)變化。結果與糖尿病對照組（B組）相比，RS干預組（C組、D組）糖耐量各時(shí)間點(diǎn)血糖值及曲線(xiàn)下面積比明顯下降；血胰島素水平顯著(zhù)降低，而胰島素敏感指數顯著(zhù)升高；血脂各項指標下降；肝脂肪變性明顯減輕，肝糖原合成增加。結論RS可改善糖尿病模型大鼠的糖脂代謝紊亂，提高胰島素敏感性，具有拮抗或減輕胰島素抵抗的作用。

關(guān)鍵詞：胰島素抵抗； 抗性淀粉； 糖尿病大鼠； 干預


糖尿病是對人類(lèi)健康損害最大、耗費社會(huì )醫療資源最多的慢性病之一，將成為本世紀重大的公共衛生問(wèn)題和社會(huì )問(wèn)題。研究表明[1]，胰島素抵抗（insulin resistance, IR）在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著(zhù)極其重要的作用，并且在肥胖癥、高血壓和心腦血管疾病中扮演著(zhù)重要角色，探討IR的機制及其改善措施是近年來(lái)國內外研究的熱點(diǎn)，也是防治2型糖尿病關(guān)鍵所在和最新治療策略。為此，我們在前期實(shí)驗已證實(shí)Hi-maize 1043抗性淀粉（resistant starch ,RS）可改善大鼠中紅花油誘導的胰島素抵抗的基礎上[2]，進(jìn)一步觀(guān)察RS對2型糖尿病大鼠IR的干預作用，為RS的臨床應用提供實(shí)驗和理論依據。

1 材料與方法
1.1 動(dòng)物與飼料
1.1.1 動(dòng)物來(lái)源
Wistar雄性大鼠40只，體重170～190克，清潔級，由新疆醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供。
1.1.2 飼料
由中國醫學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物研究所配制，分為基礎飼料（N）、高脂飼料（F）、高脂RS飼料（HS）和單純RS飼料（LFS）4種，均為化學(xué)純合飼料，配方如表1。高脂飼料和高脂RS飼料中蛋白質(zhì)、碳水化合物和紅花油提供的能量之比為15/26/59[3]。 基礎飼料根據AIN-93標準[4]配制，用Hi-maize 1043替代基礎飼料的部分玉米淀粉即為單純RS飼料，兩者均不含紅花油。Hi-maize 1043抗性淀粉由國民淀粉上海有限公司提供，是一種玉米來(lái)源的天然淀粉。


1.1.3 分組和喂養
根據體重隨機選取10只大鼠飼以基礎飼料（正常對照組），其余30只食用高脂飼料（模型組），飼養10周后，模型組大鼠進(jìn)行腹腔鏈脲霉素（STZ）注射，72小時(shí)后進(jìn)行葡萄糖耐量試驗（GTT），并取3只正常大鼠、4只模型大鼠麻醉處死，取胰腺作病理切片。對空腹血糖大于7.8mmol/L和餐后 2h血糖大于11.1mmol/L的大鼠，按體重和胰島素敏感指數均衡原則隨機分為三組，每組7只，分別飼食高脂飼料（B組即糖尿病對照組）、高脂RS飼料（C組即高脂RS干預組）、單純RS飼料（D組即單純RS干預組）；原基礎飼料組為A組（正常對照組）。繼續喂養5周后，再次進(jìn)行GTT試驗，并測量血脂、血胰島素，觀(guān)察RS對2型糖尿病大鼠的干預作用。



1.2 測量指標與方法
1.2.1 葡萄糖耐量試驗（GTT）：試驗前1日晚8時(shí)，動(dòng)物禁食。試驗當日晨7時(shí)，稱(chēng)重后經(jīng)尾尖采空腹血，測血糖及血胰島素。20%葡萄糖溶液灌胃（10ml/kg.bw）,并開(kāi)始計時(shí)，于灌胃后15、30、60、90和120min分別采血。采用美國雅培公司生產(chǎn)的“安妥”血糖儀進(jìn)行測量血糖，糖耐量曲線(xiàn)下面積比（AUC）采用幾何面積相加法。
1.2.2 血胰島素：放射免疫法，試劑盒由北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)，美國產(chǎn)DPL Gambyt CR 10放免儀。
1.2.3 胰島素敏感性指數：根據李光偉方法[5]，計算胰島素敏感性指數（ISI）。計算方法為： ISI等于空腹血糖與空腹胰島素乘積的倒數。
1.2.4 血脂：經(jīng)尾尖采血，自然凝固后分離血清，用BECMAN全自動(dòng)生化分析儀測定總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低高密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。 1.2.5 胰腺病理切片
高脂飼料喂養10周后，取3只正常大鼠、4只模型大鼠麻醉處死，取胰腺用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，HE染色，Olympus PM-10AD生物顯微鏡觀(guān)察攝影。
1.2.6 肝、腎組織病理切片
實(shí)驗末大鼠處死后，取肝組織用純酒精固定，常規石蠟包埋，肝糖原染色；取腎組織用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，六胺銀染色，Olympus PM-10AD生物顯微鏡觀(guān)察攝影。
1.3 統計學(xué)方法
采用spss for windows 11.0軟件進(jìn)行統計分析。實(shí)驗數據均采用x-±s表示，組間比較采用one-way ANOVA方差分析。

2 結果
2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立
模型組30只大鼠飼用紅花油高脂喂養10周后，腹腔注射STZ（溶于0.1M的檸檬酸緩沖液，pH4.4；注射體積：10 ml/kg；注射劑量：25mg/kg；STZ濃度：2.5mg/ml）[6]，大鼠禁食12小時(shí)尾尖采血，進(jìn)行OGTT試驗。結果發(fā)現，高脂組動(dòng)物的空腹血糖均在10mmol/L以上，餐后2h血糖均在20mmol/L以上，并有多食、多飲、多尿，體重明顯下降表現（結果見(jiàn)表2）。胰腺病理切片顯示（見(jiàn)圖1）：正常大鼠胰島結構完整、胰島內細胞形態(tài)結構正常，無(wú)異常物質(zhì)沉積；模型大鼠胰島內細胞形態(tài)結構破壞，細胞核數量減少，有粉紅色淀粉樣物質(zhì)沉積。此為2型糖尿病的胰島病變，故此認為已在大鼠中誘導出2型糖尿病。

2.2 RS對大鼠體重（BW）的影響（見(jiàn)表2）

經(jīng)高脂飼料喂養加腹腔注射STZ后，2型糖尿病模型大鼠體重明顯低于對照組（p＜0.05）。經(jīng)5周的RS干預喂養后，各糖尿病組大鼠的體重依然明顯低于對照組（A組）（p＜0.05），C組大鼠體重雖然低于A(yíng)組，但卻顯著(zhù)高于B組和D組（p＜0.05）。

2.3 RS對大鼠葡萄糖耐量與曲線(xiàn)下面積比
的影響（見(jiàn)表3）


經(jīng)5周RS干預飼養，RS干預組（C組、D組）大鼠糖耐量各時(shí)間點(diǎn)血糖值較糖尿病對照組（B組）明顯下降（p＜0.05），比正常對照組（A組）升高，但無(wú)統計學(xué)意義（p＞0.05）。糖耐量曲線(xiàn)下面積比（AUC）C組、D組大鼠較B組顯著(zhù)降低(p＜0.05)，與A組比較無(wú)差異。C、D兩組之間各指標未產(chǎn)生差異。


2.4 RS對大鼠血胰島素（FIN）及胰島素敏感指數（ISI）的影響（見(jiàn)表4）

從表4數據可見(jiàn)，實(shí)驗末RS干預組（C組、D組）大鼠血胰島素水平與糖尿病對照組（B組）相比顯著(zhù)降低（p＜0.05），與A組比較無(wú)差異。胰島素敏感指數C組、D組大鼠較B組顯著(zhù)升高（p＜0.05），與A組比較無(wú)差異。C、D兩組相比未產(chǎn)生差異。

2.5 RS對大鼠血脂的影響（見(jiàn)表5）
RS干預5周后，干預組（C組、D組）大鼠血總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）濃度顯著(zhù)低于糖尿病對照組（B組）（p＜0.05），但與A組無(wú)差異。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）干預組顯著(zhù)低于B組并高于A(yíng)組（p＜0.05）。高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）干預組（C組、D組）較B組有所升高，但無(wú)統計學(xué)意義。C、D兩組相比上述各指標均無(wú)顯著(zhù)差異。
2.6 肝、腎組織病理學(xué)觀(guān)察（見(jiàn)圖2、3）
肝組織病理切片觀(guān)察：A組大鼠肝細胞形態(tài)結構正常，胞漿內粉紅色肝糖原豐富；B組大鼠肝細胞有明顯的變性、腫脹，胞漿內粉紅色肝糖原消失；C組大鼠肝細胞變性、腫脹較B組明顯減輕，肝糖原較B組明顯增加，肝細胞胞漿內可見(jiàn)脂肪滴存在；D組大鼠個(gè)別肝細胞胞漿內有少量脂肪滴外，細胞索排列整齊，肝糖原較B組豐富。
腎組織病理切片觀(guān)察：A組大鼠腎小球毛細血管基底膜及血管系膜無(wú)增生，血管腔無(wú)狹窄；B組大鼠腎小球毛細血管基底膜增厚，血管系膜增生，腎小囊變寬；RS干預組（C組、D組）大鼠基底膜及血管系膜增生較B組有所減輕。

3 討論
胰島素抵抗（IR）及胰島β細胞功能的缺陷乃為2型糖尿病發(fā)病的病理學(xué)基礎。在IR早期，胰島細胞代償性分泌過(guò)多的胰島素，產(chǎn)生高胰島素血癥，此時(shí)血糖可完全控制正常。但隨著(zhù)IR加劇，即使額外分泌大量胰島素也不能抑制空腹及餐后血糖的升高，最后胰島β細胞終因長(cháng)期高血糖的毒性作用，負荷過(guò)重而衰竭。2型糖尿病患者胰島素水平正常或升高，但其血糖水平得不到有效控制，表現為糖耐量異常，空腹血糖升高，高脂血癥等IR特征。此外，2型糖尿病由于IR胰島β細胞分泌更多的胰島素來(lái)代償，胰島素β鏈分解產(chǎn)物增加，在胰島內形成較多的淀粉樣物質(zhì)沉淀。本實(shí)驗所用動(dòng)物模型符合以上特點(diǎn)，表明2型糖尿病大鼠模型制作是成功的。

2型糖尿病IR主要表現在肝臟、肌肉和脂肪組織，肝臟IR表現為肝糖原輸出增加，是引起空腹高血糖的主要原因。本實(shí)驗干預組大鼠肝糖原較糖尿病對照組明顯增加，表明RS可減少肝糖原分解，減少肝糖原輸出，減輕肝臟胰島素抵抗，使血糖下降。其機制可能為：RS能抵抗淀粉酶的消化，基本上完全通過(guò)小腸進(jìn)入大腸，結腸中完全發(fā)酵重吸收的特殊代謝方式，使餐后血糖以緩慢而持續的速度增加。RS也是一種不溶性纖維，沒(méi)有粘滯性，在結腸微生物的作用下發(fā)酵，釋放出有代謝活性的短鏈脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸）。這些短鏈脂肪酸可被結腸上皮細胞利用和通過(guò)肝門(mén)靜脈進(jìn)入血循環(huán)，影響脂肪組織中的脂肪分解、肝臟糖異生和胰島素分泌[7]。最新研究顯示[8、9]，門(mén)靜脈的短鏈脂肪酸濃度增加對肝臟代謝有影響，如增加肝細胞與胰島素結合。丙酸有胰島素樣作用，可刺激糖酵解、激活離體肝細胞的糖原合成、減少糖異生，從而降低血糖。本實(shí)驗結果符合以上觀(guān)點(diǎn)。
IR存在時(shí)，肝臟正常的生理活動(dòng)受到影響，使游離的脂肪酸（FFA）及TG合成增多，而FFA和TG又會(huì )降低胰島素的敏感性，從而造成脂質(zhì)代謝紊亂的惡性循環(huán)。2型糖尿病伴發(fā)高脂血癥的機制在于其存在著(zhù)IR，而IR可以直接導致脂代謝紊亂[10]。首先，脂肪細胞膜上受體對胰島素敏感性下降，使抗脂的作用減弱，大量的脂肪酸釋放入血，為T(mén)G合成提供了豐富的原料。其次，肝臟脂蛋白酯酶活性降低，肝臟攝取極低密度脂蛋白（VLDL）代謝的殘粒減少，TG清除障礙；同時(shí)，VLDL-C向HDL-C的轉化受阻，導致HDL- C降低。再次，LDL的載脂蛋白E（ApoE）糖化，使LDL-C經(jīng)其受體途徑清除作用減弱。因此，脂質(zhì)代謝紊亂常以TC、TG增高，HDL-C水平降低，LDL-C和VLDL-C水平升高為特征[7、3]。本實(shí)驗中首先采用紅花油高脂飼料喂養大鼠誘導出胰島素抵抗，再聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射造成2型糖尿病大鼠模型，模型組大鼠血糖、TC、TG、LDL-C明顯增高，HDL-C明顯降低，其血脂含量改變與實(shí)驗理論相吻合，符合臨床2型糖尿病特征。當經(jīng)過(guò)RS干預實(shí)驗5周后，干預組大鼠TC、TG及LDL-C較對照組明顯降低，HDL-C較對照組有所升高。故此認為RS具有改善2型糖尿病大鼠脂代謝紊亂的作用。
本實(shí)驗所采用的反映胰島素敏感性的指標為ISI[11]，與世界公認的金指標“胰島素鉗夾技術(shù)”高度相關(guān)，但又較其簡(jiǎn)便易行，實(shí)驗結果顯示，RS可明顯提高糖尿病模型大鼠的ISI，從而增加胰島素敏感性，降低胰島素抵抗。
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