2.1 常規危險因素調查
結合國內外乳腺癌危險因素的研究現狀，選擇與乳腺癌發(fā)生有明顯關(guān)聯(lián)的因素并結合其醫學(xué)及社會(huì )學(xué)特征將其定量或分等級調查。調查內容主要包括以下四個(gè)方面：(1)人口社會(huì )學(xué)特征：年齡、文化程度、BMI值、家庭收入、Engel系數等；(2)月經(jīng)、生殖因素：初潮年齡、初婚年齡、初產(chǎn)年齡、產(chǎn)次等；(3)生活方式：飲酒、吸煙及被動(dòng)吸煙、飲茶、人際關(guān)系等；(4)既往疾病史及家族史：內科病史、外科病史、生殖系統疾病史、乳腺良性疾病史等共54項指標。

2.2 膳食調查
采用周紫垣等[1]制定的重慶地區人群半定量食物頻數問(wèn)卷調查表，該表包括了谷類(lèi)、瓜茄類(lèi)、豆類(lèi)及豆制品、水果類(lèi)、堅果類(lèi)等12大類(lèi)共119種食物的食用頻率以及每次食用相當于份重的倍數。所有的問(wèn)卷調查均由經(jīng)培訓的調查員按統一標準實(shí)施。調查過(guò)程中主要詢(xún)問(wèn)被調查者過(guò)去1年(乳腺疾病患者調查患病前1年)的膳食攝入情況以及近年來(lái)膳食結構的變化情況，同時(shí)還兼顧了食物的季節供應系數和個(gè)人飲食習慣。當天完成的調查記錄由專(zhuān)職核查員核查并輸入。

2.3 標本搜集和處理
所有研究對象在抽血前晚均進(jìn)行低脂飲食，并于當日上午7時(shí)～9時(shí)抽取空腹靜脈血5～7ml，EDTA抗凝。對于絕經(jīng)前女性，就近抽取卵泡中期或黃體中期的血樣。乳腺癌及乳腺良性疾病組抽血均在術(shù)前完成。血樣經(jīng)專(zhuān)人用冰盒運回實(shí)驗室，并在低溫條件下分離成血漿、白細胞和紅細胞后分裝并置于液氮中保存。

2.4 試驗人群體內脂肪酸組成譜檢測
2.4.1 樣品的預處理
血漿的預處理按照Masood等[2]的方法，按照甲酯化一步法進(jìn)行。
2.4.2 氣相檢測
通過(guò)色譜條件優(yōu)化，保證混合脂肪酸甲酯標準品(Sigma公司)中的37個(gè)組分具有良好的分離度和重現性。色譜條件為Agilent 6890N氣相色譜儀并配置氫離子火焰檢測器（FID）。采用DB-23石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent J&W Scientific公司)，載氣為高純氮氣（99.999％）。運用程序升溫法，初始溫度50℃，保持1min，以25℃/min升至175℃，再以4℃/min升至230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為260℃，分流比采用50 ∶1。
2.4.3 氣相結果分析
在相同色譜分析條件下進(jìn)行樣品的檢測，根據樣品與標準品的保留時(shí)間對比確定樣品色譜圖中各峰的種類(lèi)。再用面積歸一化法來(lái)計算各脂肪酸的相對百分含量。各脂肪酸的百分含量＝(各脂肪酸峰面積/脂肪酸峰面積總和)×100%。
2.5 血漿性激素水平檢測
為了排除其它因素對性激素水平的干擾，本研究部分剔除了各試驗人群中月經(jīng)紊亂者、近6個(gè)月內哺乳或妊娠者以及近6個(gè)月內服用過(guò)雌激素或進(jìn)行激素替代治療者。各組樣品采用電化學(xué)發(fā)光法(Elecsys 2010，羅氏公司)檢測血漿中雌二醇(Estradiol, E2, pg/ml)、孕酮(Progestrone, P, ng/ml)以及睪酮(Testosterone, T, ng/ml)的水平，試劑代碼如下：E2(03000079)、P(12145383)、T(11776061)。
所有的血漿樣品均在同一個(gè)實(shí)驗室、同一個(gè)批次內檢測完。激素的檢測限如下：E2(5.0pg/ml)、P(0.03ng/ml)、T(0.02ng/ml)。參照Hankinson等(1998)的方法，對于樣品激素水平在檢測限以下的，取該檢測限的一半作為檢測結果。

3.統計分析
運用SPSS13.0軟件進(jìn)行實(shí)驗資料的統計分析。采用相對危險度的近似估計值比數比(OR)及其95％可信限(CI)來(lái)估計各危險因素與乳腺癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)強度。乳腺癌相關(guān)危險因素轉化成等級資料表示，并用非條件logistic回歸經(jīng)單因素和多因素檢驗來(lái)判斷絕經(jīng)前、后乳腺癌及乳腺良性疾病的主要危險因素。正態(tài)分布的連續型變量(如膳食營(yíng)養素攝入水平)的水平以x-±s表示，用方差分析比較各組之間的差異。非正態(tài)分布的指標(如血漿游離脂肪酸水平以及性激素水平)用中位數及P25~P75的百分位間距表示，并用秩和檢驗來(lái)比較三組人群的水平差異。
主要研究結果
1.研究對象的人口社會(huì )學(xué)特征
在2004年6月至2006年12月期間，通過(guò)以醫院和社區為基礎的病例-對照調查，剔除拒絕參加全部調查內容者、客觀(guān)上無(wú)法配合者以及資料(包括SQFFQ調查、血樣)丟失或不全者，按月經(jīng)狀態(tài)分層后，最后納入研究的人數及各組人群的年齡、居住地、教育水平、家庭收入等人口社會(huì )學(xué)特征見(jiàn)表1(其中A組代表乳腺良性疾病組，B組代表乳腺癌組，C組代表健康對照組，以下表格與此同)。
2.乳腺癌的常規危險因素研究
將常規因素調查表中的54個(gè)變量逐個(gè)引入非條件Logistic回歸模型進(jìn)行單因素分析，在α＝0.10的水平上篩選出具有顯著(zhù)意義的變量，隨后對此單因素分析的結果以年齡作為協(xié)變量進(jìn)行多因素回歸，最終在α＝0.05水平上選擇回歸模型的危險因素。經(jīng)分析，絕經(jīng)前、后乳腺癌發(fā)生的共同危險因素為教育程度高(OR:8.49,5.95)、精神傷害史(OR:2.08,9.03)、經(jīng)常痛經(jīng)(OR:4.15,16.67)、乳腺良性疾病史(OR:8.70,5.68)以及惡性腫瘤家族史(OR:3.41,8.23)，而人際關(guān)系好(OR:0.27,0.15)和月經(jīng)規則(OR:0.47,0.19)為共同的保護因素；此外，影響絕經(jīng)前乳腺癌發(fā)生的因素還有流產(chǎn)次數多(OR:3.55)、初潮年齡大(OR:0.16)和累計哺乳時(shí)間長(cháng)(OR:0.26)，而絕經(jīng)后BMI值大(OR:3.66)、行經(jīng)年數長(cháng)(OR:3.95)和生殖系統疾病史(OR:3.77)亦為乳腺癌發(fā)生的危險因素，具體結果見(jiàn)表2。影響乳腺良性疾病發(fā)生的主要因素與此類(lèi)似，主要是教育程度高、職業(yè)接觸少、人際關(guān)系好、初產(chǎn)年齡大、累積哺乳時(shí)間長(cháng)、行經(jīng)年數長(cháng)以及惡性腫瘤家族史等。
3.膳食脂肪酸攝入與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性
3.1 各組人群膳食營(yíng)養素攝入水平及其與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險
結合半定量食物頻數表的調查結果運用中國食物成分表(2002，2004)來(lái)計算該對象平均每天的能量、總蛋白、總脂肪、膳食纖維等常量營(yíng)養素以及各種脂肪酸的攝入量，計算結果按照人群分組和月經(jīng)狀況分類(lèi)保存。經(jīng)方差分析發(fā)現，各組間的膳食總能量、碳水化合物、蛋白質(zhì)、總脂肪、膽固醇、SFA及n3 PUFA的攝入水平在絕經(jīng)前、后均無(wú)明顯差異。同時(shí)，乳腺癌組的膳食纖維及MUFA攝入水平在絕經(jīng)前顯著(zhù)低于乳腺良性疾病組和健康對照組(P＜0.05)，而n6 PUFA攝入水平及n6/n3比均顯著(zhù)高于乳腺良性疾病組和健康對照組(P＜0.05)，乳腺良性疾病組和健康對照組之間無(wú)顯著(zhù)性差異；在絕經(jīng)后期，乳腺癌組及乳腺良性疾病組的膳食纖維及MUFA攝入水平顯著(zhù)低于健康對照組(P＜0.05)，而n6 PUFA攝入水平及n6/n3比均顯著(zhù)高于健康對照組(P＜0.05)，乳腺癌組和乳腺良性疾病組之間無(wú)顯著(zhù)性差異。
各組人群膳食攝入營(yíng)養素的水平以及組間比較的結果見(jiàn)3。進(jìn)一步分析膳食營(yíng)養素攝入水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險，采用Logistic回歸分析并以年齡、總能量和各組相應的危險因素來(lái)調整OR值，結果發(fā)現與最低分位數相比，絕經(jīng)前、后期最高分位水平的膳食纖維(OR:0.52,0.48)及MUFA(OR:0.64,0.59)攝入對乳腺癌發(fā)病具有保護作用，而高水平的n6 PUFA攝入(OR:1.67,2.15)及n6/n3比(OR:1.54, 2.89)則是乳腺癌的危險因素。

表1研究對象的人口社會(huì )學(xué)特征

Table 1Baseline characteristics of cases and control subjects

表2乳腺癌的多因素logistic回歸分析結果
Table 2Multifactors logistic regression analysis of the breast cancer group

表3各組人群膳食營(yíng)養素的攝入水平
Table 3Baseline characteristics of average daily nutrients intake among cases and controls

3.2 各組人群膳食脂肪酸的攝入水平

根據膳食調查結果計算乳腺癌組、乳腺良性增生組以及健康對照組平均每日攝入的總脂肪酸以及各種脂肪酸的質(zhì)量，換算成單一脂肪酸占總脂肪酸的比例，得到各組人群的膳食脂肪酸攝入水平，并以方差分析比較差異。結果顯示，乳腺癌組的膳食C18∶1攝入比例在絕經(jīng)前顯著(zhù)低于乳腺良性疾病組和健康對照組(P＜0.05)，而C18∶2攝入比例顯著(zhù)高于乳腺良性疾病組和健康對照組(P＜0.05)，乳腺良性疾病組和健康對照組之間無(wú)顯著(zhù)性差異；在絕經(jīng)后期，乳腺癌組及乳腺良性疾病組的C18∶1攝入比例顯著(zhù)低于健康對照組(P＜0.05)，而C18∶2攝入比例顯著(zhù)高于健康對照組(P＜0.05)，乳腺癌組和乳腺良性疾病組之間無(wú)顯著(zhù)性差異，具體結果見(jiàn)表4。

4.血漿脂肪酸組成譜與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性
計算各脂肪酸占總脂肪酸的百分比并建立各組人群血漿脂肪酸組成譜的本底數據庫，結果見(jiàn)表5-6。進(jìn)一步分析血漿總的SFA、MUFA、PUFA以及主要游離脂肪酸的不同水平與乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性，并用年齡、總能量以及各期內乳腺癌相應的危險因素作為協(xié)變量調整OR值，結果發(fā)現與最低分位數相比，絕經(jīng)前、后期最高水平的C16∶0(OR:0.34,0.48)、C18∶1(OR:0.57,0.42)對乳腺癌的發(fā)生具有保護作用，而高水平的C18∶2則是乳腺癌發(fā)生的危險因素(OR:2.31,2.67)。此外，絕經(jīng)前期女性血漿高水平的C18∶0也能增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(OR:2.35)，具體結果見(jiàn)表7-8。

表4各組人群膳食脂肪酸的攝入水平
Table 4Baseline characteristics of average daily fatty acid intake among cases and controls

表5絕經(jīng)前期試驗人群血漿脂肪酸的組成譜
Table 5Plasma fatty acid profile in the premenopausal study population

表6絕經(jīng)后期試驗人群血漿脂肪酸的組成譜
Table 6Plasma fatty acid profile in the postmenopausal study population

續表6

表7絕經(jīng)前期試驗人群血漿脂肪酸水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險
Table 7Levels of plasma fatty acids and risk of breast cancer in the premenopausal study population

表8絕經(jīng)后期試驗人群血漿脂肪酸水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險
Table 8Levels of plasma fatty acids and risk of breast cancer in the postmenopausal study population

* OR adjusted for age, energy and the conventional risk factors of breast cancer in postmenopausal period.

表9試驗人群血漿性激素水平
Table 9Plasma sex hormone levels in the study population

5.血漿性激素水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性
按照月經(jīng)狀態(tài)及采血時(shí)間將研究時(shí)期分成卵泡期、黃體期及絕經(jīng)后期，此時(shí)重新篩選各個(gè)時(shí)期的乳腺癌的危險因素。性激素的檢測結果用中位數及百分位間距表示，用Wilcoxon秩和檢驗比較三組人群的水平差異，結果發(fā)現，乳腺癌患者三個(gè)時(shí)期內的雌二醇水平、黃體期的孕酮水平和絕經(jīng)后期的睪酮水平均顯著(zhù)高于健康對照組(P＜0.05)，其余時(shí)期的水平比較均無(wú)顯著(zhù)差異，結果見(jiàn)表9。進(jìn)一步分析性激素的不同暴露水平對乳腺癌發(fā)病的影響并用年齡及各期內相應的危險因素調整OR值，結果發(fā)現與最低分位數相比，三個(gè)時(shí)期血漿高水平的雌二醇(OR:2.71,4.46，3.62)、黃體期內高水平的孕酮(OR:4.71)以及絕經(jīng)后期高水平的睪酮(OR:2.16)與乳腺癌的發(fā)病呈正相關(guān)，結果見(jiàn)表10。

表10血漿性激素水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險
Table 10Levels of plasma sex hormone and risk of breast cancer in the study population

討論
在本次病例-對照研究中，由于乳腺癌的發(fā)病年齡主要在圍絕經(jīng)期，而要以年齡為匹配因素進(jìn)行乳腺癌-乳腺良性疾病-健康對照的配對試驗可能會(huì )導致部分良性疾病患者以及健康對照者無(wú)法納入研究，在此本課題僅以疾病類(lèi)型和月經(jīng)狀態(tài)作為試驗人群的納入標準，經(jīng)統計發(fā)現絕經(jīng)前的乳腺癌組平均年齡顯著(zhù)低于乳腺良性疾病組以及健康對照組，而絕經(jīng)后期三組人群之間的年齡水平無(wú)顯著(zhù)性差異。因此，對于絕經(jīng)前人群我們主要是針對各種營(yíng)養素的供能比例以及攝入比例進(jìn)行討論，而絕經(jīng)后人群可同時(shí)針對攝入量和比例進(jìn)行討論。此外，在探討營(yíng)養素攝入、體內脂肪酸以及性激素水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險時(shí)，我們使用年齡、總能量以及各組相應的危險因素作為協(xié)變量來(lái)調整OR值以盡可能地排除干擾因素對營(yíng)養素暴露風(fēng)險的判定，由此我們可以認為本次研究能夠較好地判斷各組人群之間膳食脂肪酸攝入、體內脂肪酸組成、性激素水平的差異以及相應指標暴露水平與乳腺癌發(fā)生的相對風(fēng)險。
1.乳腺癌常規危險因素探討
乳腺癌是危害女性健康的主要疾病，其發(fā)生率和致死率占惡性腫瘤之首。近年來(lái)，包括發(fā)展中國家在內的所有國家乳腺癌的發(fā)病率都出現顯著(zhù)升高，這表明非遺傳因素的改變對乳腺癌發(fā)生有重要影響。國內外學(xué)者對乳腺癌的病因進(jìn)行了廣泛研究[3,4]，但由于各種危險因素在不同地區的分布及暴露水平存在差異，同時(shí)各類(lèi)研究在調查設計、人群來(lái)源/規模、研究方法以及指標檢測/評價(jià)方法等方面本身也存在較大差異，因此目前關(guān)于生活方式、月經(jīng)生殖因素以及脂肪酸和性激素的暴露水平對乳腺癌影響的結論并不統一。有基于此，本課題首先探討了重慶地區乳腺癌的主要危險因素及其暴露水平，為進(jìn)一步的脂肪酸和性激素研究提供理論基礎，并為重慶市女性乳腺癌的防治策略提供科學(xué)依據。本研究結果提示，乳腺癌發(fā)病多為教育程度高、精神壓力較大、經(jīng)常痛經(jīng)且有乳腺良性疾病史以及惡性腫瘤家族史的婦女，而流產(chǎn)次數多的絕經(jīng)前婦女和BMI值大、行經(jīng)年數長(cháng)及有生殖系統疾病史的絕經(jīng)后婦女亦為乳腺癌發(fā)病的高危人群。此外，人際關(guān)系好、月經(jīng)規則、初潮年齡大以及累積哺乳時(shí)間長(cháng)等因素能在絕經(jīng)前、后不同程度地預防乳腺癌的發(fā)生。

2.脂肪酸水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性研究
我們結合近年來(lái)居民膳食結構變遷的實(shí)際以及各種脂肪酸對健康的不同影響，采用半定量食物頻數表調查并比較了重慶地區健康女性及乳腺癌患者膳食營(yíng)養素的攝入水平，并進(jìn)一步分析膳食營(yíng)養素攝入水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險。研究發(fā)現，各組間的膳食總能量(絕經(jīng)前期乳腺癌患者膳食攝入能量降低主要是由于該組年齡偏大所致，實(shí)際差異并無(wú)顯著(zhù)性)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、總脂肪、膽固醇、SFA及n3 PUFA的攝入水平在絕經(jīng)前、后均無(wú)明顯差異。同時(shí)，乳腺癌組的膳食纖維及MUFA攝入水平在絕經(jīng)前顯著(zhù)低于乳腺良性疾病組和健康對照組，而n6 PUFA攝入水平及n6/n3比均顯著(zhù)高于乳腺良性疾病組和健康對照組，乳腺良性疾病組和健康對照組之間無(wú)顯著(zhù)性差異；在絕經(jīng)后期，乳腺癌組及乳腺良性疾病組的膳食纖維及MUFA(C18∶1)攝入水平顯著(zhù)低于健康對照組，而n6 PUFA(C18∶2)攝入水平及n6/n3比均顯著(zhù)高于健康對照組，乳腺癌組和乳腺良性疾病組之間無(wú)顯著(zhù)性差異。進(jìn)一步分析膳食營(yíng)養素攝入水平與乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險，發(fā)現絕經(jīng)前、后期高水平的膳食纖維及攝入對乳腺癌發(fā)病具有保護作用，而高水平的n6 PUFA攝入和n6/n3比則是乳腺癌的危險因素。該結果還提示，膳食因素在絕經(jīng)前、后的乳腺癌發(fā)生中均起著(zhù)重要作用，其中膳食纖維、MUFA及n6 PUFA能顯著(zhù)影響乳腺癌的發(fā)生，而該類(lèi)因素僅在絕經(jīng)后期與乳腺良性疾病的發(fā)生相關(guān)。
由于膳食調查過(guò)程中，疾病的診斷和治療可能會(huì )對調查對象膳食的回憶產(chǎn)生影響，同時(shí)不同個(gè)體在攝入同樣種類(lèi)和數量的脂肪酸后，其體內吸收、代謝以及儲存的程度也可能存在差異，因此脂肪酸攝入水平的估計并不能等同于脂肪酸的體內組成水平。為了進(jìn)一步分析脂肪酸水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性，我們用氣相色譜法建立了各組人群血漿脂肪酸組成譜的本底數據庫，并分析了血漿總的SFA、MUFA、PUFA以及主要游離脂肪酸的不同水平與乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性。研究發(fā)現，血漿高水平的n6 PUFA(C18∶2)是絕經(jīng)前、后乳腺癌發(fā)生的危險因素，而MUFA(C18∶1)對乳腺癌的發(fā)生則有保護作用。研究同樣未發(fā)現總SFA以及各種n3 PUFA水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性，但針對SFA的分類(lèi)研究顯示，血漿高水平的C16∶0對絕經(jīng)前、后的乳腺癌發(fā)生具有較顯著(zhù)的保護作用，而血漿高水平的C18∶0可以增加絕經(jīng)前乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險。
脂肪酸膳食攝入以及血漿水平的檢測結果一致發(fā)現n6 PUFA(主要是C18∶2)可增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險，而MUFA(主要是C18∶1)水平則與該風(fēng)險呈負相關(guān)。研究認為，n6 PUFA，主要是C18∶2，可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生并通過(guò)增加環(huán)加氧酶和脂氧合酶的活性從而促進(jìn)癌細胞的增殖和轉移。動(dòng)物試驗表明n6 PUFA攝入增加會(huì )上升乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險[5]，而人群研究中亦發(fā)現膳食及體內高水平的n6 PUFA會(huì )上升乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險[6]。同時(shí)，一些動(dòng)物實(shí)驗提示橄欖油中的MUFA相對于其它能量來(lái)源而言，可能對乳腺癌的發(fā)生具有保護作用，而西歐的病例-對照研究中也觀(guān)察到乳腺癌患病危險性與MUFA水平呈負相關(guān)[7,8]。本研究未觀(guān)察到n3 PUFA在膳食攝入以及血漿水平上與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性，這可能與n3 PUFA的含量較少有關(guān)，同時(shí)考慮到n3 PUFA與n6 PUFA在體內效應的相互作用，研究認為n6/n3比例的改變值得關(guān)注[9]，且n6/n3比例較單純的n3或n6 PUFA水平與乳腺癌的發(fā)生有更好的相關(guān)性。結合上述結果，本研究認為，合理的n6/n3比例以及SFA∶MUFA∶PUFA比例可能是影響乳腺癌發(fā)生的主要因素。居民應當在合理控制總脂肪、總SFA的前提下，適當降低n6 PUFA的攝入而增加n3 PUFA及MUFA的攝入。國際脂類(lèi)學(xué)會(huì )推薦的膳食n6/n3比為4～6∶1。重慶地區居民膳食中n3系列脂肪酸的來(lái)源比較少，這提示居民在日常膳食中應適量增加深海魚(yú)類(lèi)以及富含α亞麻酸的食物(包括紫蘇油)的攝入。同時(shí)，針對美國心臟協(xié)會(huì )推薦的膳食脂肪中SFA∶MUFA∶PUFA比例為1∶1∶1而2000年日本的脂質(zhì)比例推薦量為3∶4∶3，張堅等[10]在調查我國居民膳食脂類(lèi)攝入量時(shí)認為我國居民的攝入比為1∶1.5∶1更為合理。因此，居民應控制動(dòng)物性油脂和植物油的攝入，同時(shí)增加調和油以及橄欖油的使用以預防乳腺癌的發(fā)生。
3.性激素水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性研究
乳腺組織是性激素的主要靶器官，大量研究顯示性激素水平在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著(zhù)重要作用，同時(shí)月經(jīng)、生殖因素如初潮年齡、首次妊娠年齡、行經(jīng)年數等也主要是通過(guò)影響女性雌、孕激素的暴露水平來(lái)影響乳腺癌的發(fā)生。然而，目前關(guān)于性激素水平與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性研究結果并不統一，這可能與不同研究間的研究人群、樣本數目、研究方案以及實(shí)驗室檢測方法的差異有關(guān)。由于絕經(jīng)前婦女體內的性激素水平受下丘腦-垂體-性腺軸的周期性調節，因此雌、孕激素的水平在卵泡期及黃體期內的差異較大。為了盡可能多地納入研究樣本，本試驗根據絕經(jīng)前婦女的具體情況就近抽取了卵泡中期(月經(jīng)周期第7±1d；或是從月經(jīng)第一天起，在＜平均月經(jīng)周期天數－14＞/2天后取血)或黃體中期(月經(jīng)周期第21±1d；或是從月經(jīng)第一天起，下次月經(jīng)第一天的日期往回推7天取血)的血樣，并在該部分的探討時(shí)排除了月經(jīng)紊亂者、近6個(gè)月內哺乳或妊娠者以及近6個(gè)月內服用過(guò)雌激素或進(jìn)行激素替代治療者以避免混雜因素對檢測結果的判斷。按照月經(jīng)狀態(tài)及采血時(shí)間將研究時(shí)期分成卵泡期、黃體期及絕經(jīng)后期，此時(shí)重新篩選各個(gè)時(shí)期的乳腺癌的危險因素(結果略)。比較三組人群的血漿性激素水平的差異，結果發(fā)現乳腺癌患者三個(gè)時(shí)期內的雌二醇水平、黃體期的孕酮水平和絕經(jīng)后期的睪酮水平均顯著(zhù)高于健康對照組，其余時(shí)期的水平比較均無(wú)顯著(zhù)差異；而乳腺良性疾病組僅在黃體期和絕經(jīng)后期內雌二醇水平顯著(zhù)高于對照組，其余各期內的激素水平均無(wú)差異。進(jìn)一步分析性激素的不同暴露水平對乳腺癌發(fā)病的影響并用年齡及各期內相應的危險因素調整OR值，結果發(fā)現三個(gè)時(shí)期血漿高水平的雌二醇、黃體期內高水平的孕酮以及絕經(jīng)后期高水平的睪酮均能增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險。以上結果提示，雌二醇水平升高與乳腺癌發(fā)生呈顯著(zhù)的正相關(guān)，同時(shí)黃體期內孕酮水平的升高以及絕經(jīng)后期睪酮水平的升高亦能增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險。對于乳腺良性疾病，本研究發(fā)現黃體期以及絕經(jīng)后期雌二醇水平上升可導致該類(lèi)疾病風(fēng)險增加，并未發(fā)現孕酮和睪酮水平與其發(fā)生的相關(guān)性。

Hulka B認為膳食脂肪影響乳腺癌發(fā)生的機制可能是通過(guò)改變機體的體脂分布進(jìn)而影響循環(huán)雌激素水平來(lái)完成[11]。高脂膳食的攝入會(huì )導致總能量攝入的增加和體重增長(cháng)，而對于絕經(jīng)后婦女其體內的雌激素水平主要來(lái)自于脂肪組織的合成。研究發(fā)現，乳腺組織中脂肪含量與雌激素合成的關(guān)鍵酶-芳香化酶的活性呈正相關(guān)，而脂肪細胞本身也可以分泌胰島素樣生長(cháng)因子和瘦素等激素從而促進(jìn)乳腺細胞的增殖并上調芳香化酶的活性[12]。此外，人群干預試驗也發(fā)現低脂、高膳食纖維膳食能夠顯著(zhù)降低循環(huán)雌激素水平，并推測這可能與膳食纖維攝入較多而導致糞便中雌激素排泄增加有關(guān)[13]。本研究未觀(guān)察到各組人群間膳食總脂肪以及總SFA的攝入水平的差異，但是乳腺癌組膳食纖維的攝入水平顯著(zhù)低于健康對照組，這可能與該組人群的雌激素水平升高有一定的關(guān)系。我們將在后續性試驗中進(jìn)一步分析脂肪酸的攝入及體內組成水平與體內性激素水平的相關(guān)性，同時(shí)研究不同脂肪酸攝入對雌激素合成、代謝的影響以探討脂肪酸影響雌激素水平的相關(guān)分子機制。

第二部分動(dòng)物實(shí)驗
在動(dòng)物實(shí)驗方面，已成功復制出MNU誘導的SD大鼠乳腺癌模型。通過(guò)嚴格的對喂控制，持續喂養18周并相應記錄大鼠的體重、攝食量及腫瘤發(fā)生情況。分別在實(shí)驗的第8和18周處理大鼠，留取乳腺(癌)組織，－80℃保存備用。實(shí)驗數據用x-±s表示，已采用SPSS10.0建立數據庫并完成對大鼠體重、攝食量、腫瘤發(fā)生率、腫瘤多發(fā)率及乳腺組織脂肪酸構成等指標的統計分析。
2.1 動(dòng)物飼料
實(shí)驗動(dòng)物采用人工合成飼料喂養。SFA主要由豬油提供；MUFA主要由橄欖油提供；n6 PUFA主要以葵花籽油提供；n3 PUFA主要以魚(yú)油提供。根據實(shí)驗設計，使總脂肪達到進(jìn)食量的15％(wt/wt)，基礎飼料按GB14924.3-2001進(jìn)行修改，配制成85％的無(wú)脂飼料。各飼料組均含有0.5％以上的亞油酸以滿(mǎn)足大鼠對必需脂肪酸的需要。同時(shí)各組飼料除脂肪酸構成不同外，其它營(yíng)養素含量和組成相同(蛋白質(zhì)、碳水化合物和粗纖維含量分別為18.7％、46.2％和5％)，且能量供給保持一致(4.12Kcal/g)。飼料每月配制1次，真空包裝后置于-20℃下避光保存。實(shí)驗前采用氣相色譜法分析豬油、橄欖油、葵花籽油和魚(yú)油的脂肪酸含量，并按比例調配。同時(shí)根據不同油脂中維生素E含量，將各組維生素E添加至同一濃度（300mg/100g）。飼料每月配制一次，真空包裝后置于-20℃避光保存，每次喂養前將飼料放至室溫后再喂飼動(dòng)物。各組飼料脂肪酸構成見(jiàn)表2.1。

表2.1動(dòng)物飼料的脂肪酸構成（％，wt/wt）
Table2.1Percentage of fatty acids in diets(% total fatty acids, wt/wt)

2.2 動(dòng)物分組和模型復制
45d齡的清潔級SD雌性大鼠186只，購于第三軍醫大學(xué)野戰外科研究所實(shí)驗動(dòng)物中心，置于標準動(dòng)物房普通飼料適應性喂養5d后，剔除體重過(guò)高和過(guò)低的大鼠各8只后，隨機分為SFA組、MUFA組、n6 PUFA組、n3 PUFA組、n6/n3的1∶1、5∶1、10∶1組，以及1∶2∶1(SFA∶MUFA∶PUFA為1∶2∶1，且n6∶n3為1∶1)組，共計8組。同時(shí)每組又分為實(shí)驗組(MNU組，13～14只)和對照組(生理鹽水組/對喂組，8只)。

參照Lu S等人(2002)方法，選用50天鼠齡的SD雌性大鼠，采用化學(xué)致癌劑甲基亞硝基脲(methylnitrosourea, MNU)50mg/kg體重的劑量單次腹腔注射給藥誘導大鼠乳腺癌發(fā)生，對照組注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。給藥后即喂以不同脂肪酸組的飼料，持續喂養18周。分別在實(shí)驗的8和18周處理大鼠，留取并分裝乳腺(癌)組織。

2.3 觀(guān)察指標
2.3.1 大鼠進(jìn)食量和體重
大鼠在標準動(dòng)物房中飼養，自由飲水。每2天記錄一次大鼠進(jìn)食量。根據前2天各組大鼠的攝食情況，以攝食量少者為標準，給予同樣重量的飼料以保證每組能量攝入相當。每周稱(chēng)取一次體重。
2.3.2 大鼠腫瘤發(fā)生情況
每周檢查一次大鼠乳腺腫瘤發(fā)生情況，包括腫瘤發(fā)生時(shí)間、數目以及部位以便在實(shí)驗末期統計大鼠乳腺腫瘤發(fā)生潛伏期、多發(fā)率以及發(fā)生率。實(shí)驗過(guò)程中，如果大鼠的乳腺腫瘤直徑超過(guò)1cm，也直接進(jìn)行處理并留取相應標本。
實(shí)驗數據用x-±s表示，采用SPSS10.0軟件建立數據庫，對大鼠體重、攝食量進(jìn)行重復測量資料的方差分析，腫瘤潛伏期和多發(fā)率進(jìn)行方差分析，腫瘤發(fā)生率進(jìn)行χ2檢驗。
2.3.3氣相色譜內標法分析各組大鼠乳腺組織脂肪酸構成
取各組三只大鼠乳腺組織40mg，入勻漿器用2∶1(v/v)氯仿/甲醇和0.05mol/L NaCl碾磨提取脂質(zhì)后，在N2下加入內標C17∶0和14％ BF3MeOH(含1g/L BHT)，66℃水浴2h進(jìn)行甲酯化，再用正己烷和飽和NaCl提取甲酯化的脂肪酸，N2吹干后加入100μl正己烷重溶。取1μl采用程序升溫條件進(jìn)行檢測，即50℃保持1min，以25℃/min升至175℃，再以4℃/min升至230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度250℃，檢測器溫度260℃，分流比50∶1，分析35min。每個(gè)樣品重復測定三次。然后根據各組脂肪酸和內標色譜峰峰面積的比值，用不同脂肪酸甲酯化單標的標準曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程計算各組乳腺組織脂肪酸的含量。
2.4 實(shí)驗結果
2.4.1膳食脂肪酸對大鼠攝食量以及體重的影響
自其實(shí)驗6周起，n3 PUFA組大鼠出現食欲抑制和體重增長(cháng)受阻的情況。為保障其余組大鼠的正常生長(cháng)以及攝食量的對喂控制，在其余組間選取攝食量少者為喂飼標準。統計學(xué)分析顯示，自其實(shí)驗6周起，n3 PUFA組大鼠攝食量及體重增長(cháng)顯著(zhù)低于其余各組(P＜0.01)，而其余各組的攝食量和體重均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。實(shí)驗期間，不同構成比脂肪酸對大鼠體重增長(cháng)的影響見(jiàn)圖2.1。
圖2.1不同膳食脂肪酸及構成對SD雌性大鼠體重增長(cháng)的影響
Fig 2.1Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA
on the body weight of SD female rats

**: P＜0.01 compared with other groups

2.4.2 膳食脂肪酸對大鼠乳腺腫瘤發(fā)生的影響
實(shí)驗末期，不同脂肪酸喂養的各對喂組大鼠均無(wú)乳腺腫瘤發(fā)生。在各MNU處理組中，除n3 PUFA組無(wú)乳腺腫瘤發(fā)生，其余組均有乳腺腫瘤發(fā)生，其中SFA組、MUFA組、10∶1 n6/n3組和S/M/P組的乳腺腫瘤誘發(fā)率都為92.31％（12/13），n6 PUFA組和5∶1 n6/n3組乳腺腫瘤誘發(fā)率分別為83.33％和84.62％（10/12，11/13），均約是1∶1 n6/n3組乳腺腫瘤誘發(fā)率42.86%（6/14）的2倍（χ2=17.869，P＜0.01）。此外，1∶1 n6/n3組大鼠的腫瘤多發(fā)率為0.79±1.25，顯著(zhù)低于其余各組(P＜0.01)，而其余各組間無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05)。此外，1∶1 n6/n3組MNU給藥至出現首發(fā)腫瘤的時(shí)間即潛伏期也最長(cháng)。提示，1∶1 n6/n3能有效抑制MNU誘導的乳腺腫瘤發(fā)生。見(jiàn)圖2.2，表2.2。

圖2.2不同膳食脂肪酸及構成對MNU誘導SD雌性大鼠乳腺腫瘤發(fā)生的影響
Fig 2.2Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA on MNUinduced mammary tumor incidence in SD female rats

表2.2不同膳食脂肪酸及構成對MNU誘導SD雌性大鼠
乳腺腫瘤發(fā)生情況的影響
Table 2.2Effects of different dietary fatty acids and ratios of n6/n3 PUFA on the
occurrence of MNUinduced mammary tumors in SD female rats

2.4.3 各組大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察
2.4.3.1組織病理學(xué)觀(guān)察(HE染色)
處理各組大鼠并分離乳腺(腫瘤)組織，經(jīng)10％福爾馬林溶液固定24h后，石蠟包埋切片，常規HE染色，并在光鏡下觀(guān)察各組大鼠乳腺(腫瘤)組織的組織形態(tài)行。實(shí)驗發(fā)現，未發(fā)生腫瘤的各對喂組以及n3 PUFA實(shí)驗組大鼠乳腺組織呈細米粒樣大小外觀(guān)，光鏡下可見(jiàn)乳腺組織結構與同鼠齡正常大鼠相同，即腺管在乳腺組織內散在分布，結構清楚，導管上皮細胞呈單層有序排列，腺腔寬大而清晰(圖2.3A)。MNU誘導的乳腺腫瘤組織表面凸凹不平，內面可呈脂肪樣變性。經(jīng)HE染色確定各組誘發(fā)的乳腺腫瘤均為乳腺導管癌，其病理變化為乳腺腺腔的導管上皮細胞呈惡性增生，出現排列紊亂、層次不清等現象，腺腔變狹窄甚至消失(圖2.3B)。

2.4.3.1組織超微結構的改變(透射電鏡)
相同倍數下，對喂組乳腺組織可見(jiàn)完整的單個(gè)乳腺導管上皮細胞輪廓，細胞間連接緊密，細胞間質(zhì)增多，表面有豐富的微絨毛，見(jiàn)圖2.4A。而MNU誘導的乳腺腫瘤細胞輪廓不清，細胞核大、深染，呈不規則形，有明顯的核分裂相，核漿比例增大，胞漿內有大量的分泌顆粒、粗面內質(zhì)網(wǎng)及標志腺癌的微腺腔存在，細胞膜上的突起少，少見(jiàn)或無(wú)細胞間連接，見(jiàn)圖2.4B。

2.4.4 不同膳食脂肪酸對大鼠乳腺組織脂肪酸組成的影響
不同膳食脂肪酸及構成能導致大鼠乳腺組織脂肪酸組成發(fā)生明顯變化，其變化趨勢與膳食脂肪構成基本一致，且不同喂養組間的脂肪酸含量有顯著(zhù)差異(P＜0.05)。雖總的SFA含量在各喂養組間無(wú)顯著(zhù)變化趨勢，但SFA喂養組大鼠乳腺組織儲有大量的MUFA和n6 PUFA；MUFA喂養組乳腺組織C18∶1含量明顯高于其余組；n6 PUFA喂養組乳腺組織C18∶2和C20∶4的含量也顯著(zhù)高于其余組，且這三組n3 PUFA含量極低；而在n3 PUFA喂養組乳腺組織EPA、DHA含量最多，C20∶4含量最少；在n6/n3不同構成比中，其顯著(zhù)特征為1∶1 n6/n3喂養組乳腺組織DHA含量依次明顯高于5∶1和10∶1 n6/n3喂養組，C20∶4含量則依次低于5∶1和10∶1 n6/n3喂養組；而S/M/P組乳腺組織含有較多的MUFA和n6 PUFA，n3 PUFA含量明顯少于n3 PUFA和1∶1 n6/n3喂養組。此外，發(fā)現對喂和MNU誘癌組間大鼠乳腺組織脂肪酸組成變化具有相同趨勢。見(jiàn)圖2.5。