摘要 目的探討老年男性腸脂肪酸結合蛋白（intestinal fatty acid binding protein, IFABP）基因exonⅡ54位點(diǎn)編碼丙氨酸或蘇氨酸（A/T）單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）與血清血脂水平的關(guān)系。方法研究對象為114例老年男性，平均年齡71.3±7.2歲；對照組102例年輕男性，平均年齡38.2±3.1歲。利用聚合酶鏈反應（PCR），HhaI內切酶酶切，基因測序等技術(shù)檢測各組IFABP基因型；血清總膽固醇(TC)、三酯酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)、載脂蛋白B(Apo B)等指標的檢測采用生物化學(xué)方法。結果老年男性組IFABP基因型A/A、A/T、T/T頻率為0.29，0.53，0.18；對照組IFABP基因型A/A、A/T、T/T頻率為0.52，0.35，0.13。突變型54T等位基因頻率分別為：老年男性組0.45，對照組0.30。與對照組比較，老年男性組54T等位基因頻率明顯增高，差異顯著(zhù)（x2=9.41,p＜0.01；）。在老年男性組，與54A等位基因攜帶者比較，54T等位基因攜帶者血清三酯酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B明顯升高（分別為1.83±0.67 vs 1.48±0.67mmol/L, p＜0.05;2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L, p＜0.05;0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L, p＜0.05）。結論突變型54T等位基因頻率在老年男性人群中明顯升高，并且與老年男性較高水平的血清三酯酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、載脂蛋白B有關(guān)。

Abstract：Objective To investigate the association of frequency at codon 54Ala/Thr (A/T) single nucleotide polymorphism (SNP) in the intestinal faty acid binding protein (IFABP) with serum lipids in aged men. Methods Subjects were 114 elderly men aged 71.3±7.2 years. Controls were 102 younger men aged 38.2±3.1years. The Ala 54Thr allelic variant was detected by polymerase chain reaction, HhaI digestion, and sequencing. TC, TG, HDL-c, LDL-c, ApoAⅠ and ApoB in fasting serum were detected by biochemical technique. Results The genotype frequencyies of A/A, A/T, T/T were 0.29, 0.53, 0.18 in elderly men, 0.52, 0.35, 0.13 in controls. The allelic frequency of point mutant 54Thr in IFABP gene were 0.45 in elderly men，0.30 in controls, respectively. Compared with controls, the allelic frequency of 54T in elderly men was markedly difference（x2=9.41, p＜0.01）. The TG, LDL-c and ApoB concentraton in fasting serum in elderly men with 54T allele were significantly higher than these with 54A allele(1.83±0.67 vs 1.48±0.67mmol/L, p＜0.05; 2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L, p＜0.05; 0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L, p＜0.05). Conclusions In elderly men, the frequency of mutant allele 54T was significantly elevented, which was associated with high TG, LDL-c and ApoB concentraton in fasting serum.

IFABP基因位于人類(lèi)染色體4q28-q31。研究證實(shí)，IFABP與外源性長(cháng)鏈脂肪酸（long chain fatty acid, LCFA）的吸收、轉運及脂類(lèi)合成、分解代謝有關(guān)[1,2]。繼其空間結構和部分生理功能得到證實(shí)后，最近，有研究報道突變型54T IFABP與肥胖、高血脂、高血糖等“代謝綜合征”的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。老年人是這種綜合征的高危人群。本文通過(guò)對不同年齡組男性人群54A/T IFABP基因多態(tài)性調查，分析老年男性突變型54T等位基因頻率分布及其與血清血脂水平的關(guān)系。

1 材料與方法
1.1 研究對象
114例老年人，男性，年齡60-87歲，平均71.3±7.2歲，來(lái)自某部隊干休所體檢；對照組102例，男性，年齡18-45歲，平均年齡38.2±3.1歲，來(lái)自某部隊體檢。研究對象無(wú)腎功能損害，無(wú)重度吸煙史（＞10支/日），相互間無(wú)血緣關(guān)系。
1.2 試劑與儀器
限制性?xún)惹忻窰haⅠ，Taq DNA聚合酶購自TaKara公司；蛋白酶K購自Sigma公司；UNIQ-5柱離心式DNA膠回收試劑盒，PCR反應回收試劑盒購自上海生物工程有限公司。UNOⅡ型PCR儀（Biometra，德國），UV-1601型紫外分光光度計，75S/00771型凝膠成像分析系統（Bio Rad，美國）。
1.3 方法
1.3.1 PCR引物的設計根據genebank提供的人IFABP基因序列，按引物設計原則，將上游引物設計在距離突變位點(diǎn)200bp，下游引物設計在距離突變位點(diǎn)100bp，擴增產(chǎn)物長(cháng)度為300bp，即，上游引物序列：5-ACAGGTGTTAATATAGTGAAAAGG-3,下游引物序列：5-ATTGGCTTCTTCAGTTAGTGAAGG-3。GAPDH內參對照：擴增片段長(cháng)450bp，上游引物序列：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3；下游引物序列：5-TCACCACCCTGTTGCTGTA-3。
1.3.2 外周血分離白細胞及DNA提取空腹靜脈血1ml，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。采用低滲溶血法分離白細胞；酚/氯仿抽提法提取DNA。
1.3.3 目的基因IFABP擴增條件95℃預變性3分鐘；94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃補平8分鐘，反應體系為50μl。GAPDH內參擴增條件：95℃預變性3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃補平8分鐘，反應體系為25μl。
1.3.4 IFABP基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后，用限制性?xún)惹忻窰haⅠ，37℃酶切過(guò)夜。結果行3%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統攝像，并記錄分析結果。根據酶切結果，針對性地選擇部分完全切割、不完全切割和未切割的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，待DNA序列分析比較，測序分析由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
1.3.5 血清血脂測定空腹靜脈血5ml，采用Olympus AU 6400全自動(dòng)生化儀測定血清總膽固醇(TC)、三酯酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、載脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)、載脂蛋白B(ApoB)
1.4 統計學(xué)處理
等位基因頻率采用基因計數法。計量資料用x±s表示，采用SPSS1.0軟件作x2檢驗和t檢驗。

2 結果
2.1 言目的基因片段及內參基因片段的PCR擴增產(chǎn)物
以外周血白細胞DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察，在約300bp處擴增出一條與預期值相符合的特異性IFABP基因片段，GAPDH內參擴增結果為450bp。

圖1IFABP基因目的片段PCR擴增結果
1、2、3、4、5、6、7為300bp目的基因擴增片段；
8為GAPDH內參，片段長(cháng)450bp；9為2000bp Maker

2.2 限制性?xún)惹忻窰haⅠ酶切結果
PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒回收后，用限制性?xún)惹忻窰haⅠ，37℃過(guò)夜酶切。HhaⅠ內切酶堿基識別序列為GCGC。當IFABP基因54位點(diǎn)GCT（Ala）→ACT（Thr）時(shí)，其所在堿基序列片段將由GCGCT→GCACT，HhaⅠ內切酶不能酶切。酶切結果電泳分析顯示三種情況：①突變純合子型54T/T，顯示一條帶，分子量約為300bp；②野生型54A/A，顯示二條帶，分子量約為200bp和100bp；③突變雜合子型54A/T，顯示三條帶，分子量分別約為300bp，200bp和100bp。

圖2HhaⅠ酶切結果
7、9為IFABP54A/T雜合子基因型酶切結果（三條帶
分別為300bp,200bp,100bp）；1、4為IFABP54A/A
野生基因型酶切結果（二條帶分別為200bp,100bp）；
2、3、5、6、8為IFABP54T/T突變純合子基因型酶切
結果（一條帶為300bp）；10為GAPDH內參，片段長(cháng)
450bp；11為2000bp Maker
2.3 目的基因片段序列分析
為了進(jìn)一步驗證內切酶HhaⅠ酶切結果，針對性地選擇部分完全切割、不完全切割和未切割的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，進(jìn)行DNA雙向序列分析比較，結果與酶切結果吻合。
2.4 各組IFABP基因exonⅡ 54位密碼子點(diǎn)突變頻率
不同年齡組IFABP基因exonⅡ54位點(diǎn)突變情況見(jiàn)表1。老年男性組(n=114)，野生型A/A為33例，占0.29，突變雜合子型A/T60例，占0.53，突變純合子型T/T21例，占0.18；54T等位基因頻率0.45，54A等位基因頻率0.55。對照組(n=102)，野生型A/A為53例，占0.52，突變雜合子型A/T36例，占0.35，突變純合子型T/T13例，占0.13；54T等位基因頻率0.30，54A等位基因頻率0.70。兩樣本率統計分析，與對照組比較，老年男性組突變型54T等位基因頻率分布明顯增高，且差異顯著(zhù)（x2=9.41,p＜0.01）。

圖3野生型54A/A（GCT/GCT）IFABP基因片段測序圖譜（正向），“→”所示為54位點(diǎn)（GCT）

2.5 老年男性組54A/T等位基因型與血清血脂水平
的關(guān)系54T等位基因攜帶者空腹血清TG、LDL-c和ApoB水平明顯高于54A等位基因攜帶者，分別為1.83±0.67vs 1.48±0.67mmol/L，2.39±0.42 vs 2.21±0.41mmol/L；0.69±0.17 vs 0.61±0.19g/L，差異顯著(zhù)（p＜0.05）；而血清TC，HDL-c，ApoAⅠ水平，兩組間雖有差異，但無(wú)統計學(xué)意義。見(jiàn)表2。

3 討論
IFABP是一種20世紀70年代發(fā)現的胞內可溶性脂肪酸載體蛋白，屬于FABPs蛋白超家族，分子量約為15kDa，由131個(gè)氨基酸組成，分布于營(yíng)養物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所——小腸，具有組織特異性。食物來(lái)源的脂類(lèi)經(jīng)腸道膽汁酸鹽和胰酶乳化分解后，中、短鏈脂肪酸以擴散方式被腸道吸收細胞攝取，而長(cháng)連脂肪酸（C16－C20）需經(jīng)膜受體脂肪酸轉位酶FAT/CD36轉運入胞內，與IFABP結合后，被靶向運輸至胞內線(xiàn)粒體、內質(zhì)網(wǎng)等場(chǎng)所，參與體內脂類(lèi)合成、分解代謝。膜受體脂肪酸轉位酶FAT/CD36的密度、分布與IFABP基因表達密切相關(guān)。
IFABP基因表達受食物中長(cháng)鏈脂肪酸的正向調節。在腸道，從十二指腸到結腸，從絨毛頂端到腸隱窩，隨著(zhù)腸上皮細胞攝取LCFA能力的降低，IFABP基因表達呈明顯遞減的階梯狀分布。在研究IFABP基因表達調控機制中，Mochizuki等[4]發(fā)現，小腸細胞核荷爾蒙受體PPARα通過(guò)與視黃醇酸受體α（RXRα）形成PPARα-RXRα異源二聚體，作用于IFABP基因啟動(dòng)子PP反應元件（PPRE），LCFA能促進(jìn)PPARα-RXRα與PPRE結合，繼而激活I(lǐng)FABP基因表達，當食物中脂肪酸含量增加時(shí)，腸道上皮細胞IFABP基因表達明顯上升。
IFABP基因第Ⅱ外顯子54位點(diǎn)具有單核苷酸多態(tài)性（SNP），可編碼丙氨酸（A）或蘇氨酸（T）。體外實(shí)驗證實(shí)，突變型54T IFABP與配基長(cháng)鏈脂肪酸的親和力是野生型54A IFABP的2倍。從結構上，盡管54T與配基結合無(wú)明顯的直接關(guān)系，但是蘇氨酸（T）替代丙氨酸（A），使側鏈分子量增大，影響了配基進(jìn)出“入口”區域，從而降低了IFABP運輸配基的轉移率[5]。細胞學(xué)實(shí)驗證實(shí)，轉染了54T/T IFABP基因的Caco-2細胞，轉運長(cháng)連脂肪酸的能力和分泌甘油三酯(TG)的濃度均較轉染54A/A IFABP基因的Caco-2細胞增高5至6倍，推測突變型IFABP分子結構的微小改變，可能影響了脂類(lèi)的攝取及正常代謝[6]。
本實(shí)驗結果顯示，對照組年輕男性的54T等位基因頻率為0.30，此與韓國[7]、日本[8]年輕男性54T頻率分布相近。提示IFABP基因T54A多態(tài)性分布可能無(wú)民族、地域分布差異。而老年男性組，54T等位基因頻率高達0.45，兩者存在非常顯著(zhù)差異（p＜0.01）。因此，推測突變型54T IFABP基因頻率分布與年齡相關(guān)，在高年齡組頻率分布增高。
最近，國外臨床研究發(fā)現，同野生型54A相比較，突變型54T攜帶者餐后、空腹血清總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，載脂蛋白E(ApoE)，極低密度脂蛋白(VLDL)濃度及胰島素水平均明顯升高，并且持續時(shí)間延長(cháng)[8，9]。早在1992年，Patsch等[10]發(fā)現，高脂血與冠心病發(fā)生發(fā)展有明顯的正相關(guān)性。本實(shí)驗結果顯示，老年男性組，54T基因攜帶者空腹血清TG、LDL-c和ApoB均高于54A基因攜帶者（p＜0.05），提示在老年男性中，突變型54T基因可能與血清TG、LDL-c和ApoB升高相關(guān)。此結果與Jennifer等[11]報道一致。
流行病學(xué)調查已證實(shí)，年齡是冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的易患因素；高脂蛋白血癥特別是血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇增高，高密度脂蛋白膽固醇減低是其發(fā)生的主要危險因素。因此，結合IFABP基因的表達調控機制和突變型54T IFABP的生物學(xué)特征，我們推測突變型IFABP基因可能與老年男性冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化的誘發(fā)機制有關(guān)。關(guān)于這一點(diǎn)，尚待我們進(jìn)一步探討。

參考文獻：
1.Weisiger RA. Cytosolic fatty acid binding protein catalyze two distinct steps in intracellular transport of their ligands. Mol Cell Biochen, 2002, 239(1-2):35-43.
2.Boord JB, Fazio S, Linton MF. Cytoplasmic fatty acid-binding proteins: emerging roles in metabolism and atherosclerosis. Curr Opin Lipid, 2002, 13(2):141-147.
3.Albala C, Santos JL, Cifuentes M, et al. Intestinal FABP2 A54T polymorphism: association with insulin resistance and obesity in women. Obes Res, 2004, 12(2):340-345.
4.Mochizuki K, Suruga K, Yagi E, et al. The expression of PPAR-associated genes is modulated through postnatal development of PPAR subtypes in the small intestine. Biochim Biophys Acta. , 2001， 1531(1-2):68-76.
5.Zhang F, Lucke C, Baier LJ, et al. Solution structure of human intestinal fatty acid binding proteinwith a naturally-occurring single amino acid substitution (A54T) that is associated with altered lipid metabolism. Biochemistry, 2003， 42(24):7339-7347.
6.Baier LJ, Bogardus C, Sacchettini JC. A polymorphism in the human intestinal fatty acid binding protein alters fatty acid transport across Caco-2 cells. J Biol Chem, 1996,271(18):10892-10896.
7.Kim CH, Yun SK, Byun DW, et al. Codon 54 polymorphism of the fatty acid binding protein 2 gene is associated with increased fat oxidation and hyperinsulinemia, but not with intestinal fatty acid absorption in Korean men. Metabolism, 2001，50(4):473-476.
8.Ito K, Nakatain K, Fujii M, Katsuki A, et al. Codon 54 polymorphism of the fatty acid binding protein gene and insulin resistance in the Japanese population. Diabet Med, 1999，16(2):119-124.
9.Nakanishi S, Yamane K, Kamei N, et al. The effect of polymorphism in the intestinal fatty acid-binding protein 2 gene on fat metabolish is associated with gender and obesity amongst non-diabetic Japanese-Americans. Diabetes Obes Metab, 2004， 6(1):45-49.
10.Patsch JR, Miesenbock G, Hopferwieser T, et al. Relation of triglyceride metabolism and coronary artery disease. Studies in the postprandial state. Arterioscler Thromb, 1992， 12（11）:1336-1345.
11.Jennifer R, Galluzzi, Adrienne C, et al. Association of the A/T54 polymorphism in the intestinal fatty acid binding protein with variations in plasma lipids in The Framingham Offspring Study. Atherosclerosis, 2001,159(2):417-424.