Abstract: Mass spectrometry is a powerful and integrated analytical technique. This paper presented characteristics of mass spectrometry, and reviewed the application of TI-MS, ICP-MS, IRMS and HPLC-MS/MS in clinical nutrition researches.

Keywords: Mass spectrometry；Clinical nutrition

臨床營(yíng)養學(xué)是研究營(yíng)養與疾病關(guān)系的一門(mén)學(xué)科，涉及疾病的營(yíng)養代謝、營(yíng)養治療以及營(yíng)養預防。現代概念的臨床營(yíng)養，包括胃腸內營(yíng)養和胃腸外營(yíng)養，這兩種營(yíng)養支持的內容包括氨基酸、長(cháng)鏈及中鏈脂肪、糖類(lèi)、維生素、微量元素等多種成分。

既往的科學(xué)史表明，幾乎所有與生命科學(xué)有關(guān)的重大研究成果都伴隨著(zhù)大量新技術(shù)、新方法的創(chuàng )新性發(fā)展。人類(lèi)基因組計劃的迅速完成得易于分子生物學(xué)、生物質(zhì)譜等新技術(shù)的成熟和發(fā)展。隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,臨床營(yíng)養學(xué)的理論知識和應用技術(shù)也在不斷完善和提高。在最近召開(kāi)的第18th國際營(yíng)養學(xué)大會(huì )上，營(yíng)養學(xué)研究領(lǐng)域的新技術(shù)和新方法主要體現在以下兩方面：分子營(yíng)養學(xué)，如mRNA差異顯示技術(shù)，即將分子生物學(xué)中人類(lèi)基因組學(xué)中的一部分內容與營(yíng)養學(xué)進(jìn)行聯(lián)接；質(zhì)譜技術(shù)，以其進(jìn)行機體內某些營(yíng)養物的定量分析，如采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）對氨基酸，L-肉毒堿等營(yíng)養物質(zhì)進(jìn)行定量測定[1]。近年來(lái)，隨著(zhù)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）等生物質(zhì)譜技術(shù)的日益成熟和普及，質(zhì)譜在營(yíng)養學(xué)研究領(lǐng)域的應用上了一個(gè)新的臺階，能夠解決許多科研問(wèn)題，呈現出巨大的應用前景。

1 質(zhì)譜技術(shù)簡(jiǎn)介

質(zhì)譜是根據樣品離子的質(zhì)量電荷比來(lái)進(jìn)行定性、定量研究的一種分析技術(shù)。質(zhì)譜儀是一種大型、復雜而精確的儀器，它涉及到精密機械加工、真空技術(shù)，是電子、物理、化學(xué)和數理等許多學(xué)科的綜合結果。質(zhì)譜儀的核心裝置包括進(jìn)樣系統、離子源、質(zhì)量分析器和檢測器。作為一門(mén)綜合技術(shù)，質(zhì)譜具有下列特點(diǎn)：靈敏度高、進(jìn)樣量少；分析速度快；能測定同位素；分析范圍廣等。目前，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組、基因組、代謝組，以及醫藥、營(yíng)養、環(huán)境檢測等諸多領(lǐng)域得以廣泛應用。

質(zhì)譜的種類(lèi)很多，根據其用途大致可分為無(wú)機質(zhì)譜（如ICP-MS、TI-MS）、有機質(zhì)譜（如串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，離子阱質(zhì)譜）和同位素質(zhì)譜（如13C-同位素比值質(zhì)譜）。在傳統的營(yíng)養學(xué)研究中，無(wú)機質(zhì)譜和同位素質(zhì)譜的應用較多。例如，在人體鈣吸收研究中，TI-MS可用于測定元素鈣；在人體微量元素評價(jià)研究中，ICP-MS可以實(shí)現多種元素的準確測定；在脂肪和碳水化合物吸收的研究中，13C-呼氣試驗結合同位素質(zhì)譜分析是一種非常理想的研究方法。近年來(lái)，隨著(zhù)串聯(lián)四極桿、離子阱、飛行時(shí)間質(zhì)譜等有機質(zhì)譜技術(shù)的成熟和發(fā)展，有機質(zhì)譜在營(yíng)養學(xué)研究領(lǐng)域的應用也呈現出蓬勃發(fā)展的景象。

2 TI-MS在鈣吸收營(yíng)養學(xué)研究中的應用

鈣吸收研究是營(yíng)養學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)常見(jiàn)課題，常用的研究方法有鈣代謝平衡法、口服鈣負荷法、腸灌洗法、放射性核素示蹤法及雙穩定核素示蹤技術(shù)等。這些方法各有特點(diǎn)，其中，雙穩定核素示蹤法以鈣的穩定同位素作為示蹤劑來(lái)進(jìn)行鈣吸收及代謝研究，被國際營(yíng)養專(zhuān)家組（美國國家科學(xué)院醫學(xué)研究所食品與營(yíng)養委員會(huì )）接受為測定人體鈣吸收的“金標準”[2]。

在雙穩定核素測定人體鈣吸收的研究中，元素鈣的測定是研究的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題。許多質(zhì)譜技術(shù)可用于鈣穩定同位素的測定，如場(chǎng)解吸質(zhì)譜（FD-MS）、快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）、電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）和熱表面電離質(zhì)譜（TI-MS）。但只有熱表面電離質(zhì)譜（TI-MS）和快原子轟擊質(zhì)譜法（FAB-MS）被公認既準確又簡(jiǎn)單易行。快原子轟擊質(zhì)譜法（FAB-MS）設備簡(jiǎn)易,樣品制備簡(jiǎn)單（只需將尿鈣用草酸銨沉淀離心后，再以鹽酸溶解即可進(jìn)樣），是一種很好鈣元素的測定方法[3]。但與熱表面電離質(zhì)譜（TI-MS）相比，其測定的精密度和靈敏度相對要低。TI-MS是測定金屬元素同位素豐度的標準方法并被用于測定鈣穩定同位素天然豐度的標準值。以TI-MS測定鈣穩定同位素，準確度可高達100.05%，精密度小于0.01%[4]。1987年，Yergey等最早將TI-MS與雙穩定核素示蹤技術(shù)結合用以研究健康早產(chǎn)兒和青少年飲食中的鈣吸收[5]。但TI-MS測定時(shí)容易受到樣品中鉀等雜質(zhì)的干擾，因此對樣品純化的要求高，并且儀器設備比較昂貴。

3 ICP-MS在鐵、鋅、鉀等微量元素研究中的應用
微量元素則指那些在人體內含量甚微，低于人體總重量0.05%的元素。目前公認的人體必需的微量元素有鐵、銅、錳、鋅、鈷、鎳、硒、鉬、氟、硅、釩、鉻、錫和碘等14種。這些元素參與人體多種化學(xué)反應，在人的生長(cháng)、發(fā)育、衰老、疾病及死亡的過(guò)程中，起著(zhù)重要作用，是許多腸內、腸外營(yíng)養制劑中的必需成分。

由于微量元素種類(lèi)很多，為客觀(guān)反應鈣對微量元素的影響，一般不是僅考察一種或幾種元素，而是要求同時(shí)分析多種微量元素。因此，建立進(jìn)行相關(guān)研究的測定方法時(shí)，不僅需要考慮方法的靈敏度和選擇性，還應注重各元素測定的兼容性，以便能夠同時(shí)快速分析多種微量元素。但是，目前沒(méi)有任何一種分析技術(shù)能同時(shí)準確測定所有的微量元素。美國國家標準局測定微量元素標準值時(shí)常用的方法有：原子吸收光譜，熒光分析法，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES），質(zhì)子激發(fā)X射線(xiàn)熒光光譜，火花源質(zhì)譜，中子活化分析，陽(yáng)離子溶出伏安法等。ICP-MS與常用的ICP-AES有一定相似之處，這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于元素分析的兼容性好，可以同時(shí)測定多種微量元素。如Wang等用ICP-MS法測定了中藥中Fe、Cu、Zn、Ni、Cr、Co、Cd、Mn、Sr等13種微量元素[6]。結果表明，ICP-MS法簡(jiǎn)單迅速，靈敏度高，動(dòng)態(tài)線(xiàn)性范圍寬，是進(jìn)行微量元素分析的一個(gè)強有力的工具。ICP-MS的缺點(diǎn)在于儀器比較昂貴，測定穩定性較差，易受污染，記憶效應比較嚴重，而且不適合碘等元素的測定（碘常用的檢測方法是中子活化分析等）。

4 13C呼氣試驗與同位素質(zhì)譜在營(yíng)養學(xué)研究的應用
13C呼氣試驗原理是根據人體攝入的絕大部分含碳化合物都可以被氧化成CO2和H2O。13C的標記化合物在體內一系列酶的作用下氧化為13CO2，并與體內CO2庫混合，引起體內CO2中13C豐度升高，以同位素比率質(zhì)譜（IRMS）測定一定時(shí)間內呼氣中13CO2/12CO2比值的變化，就可能反應機體內某一臟器或酶催化氧化反應的速度和程度，從而為科學(xué)研究和疾病診斷提供信息。13C呼氣試驗是一種靈敏、快速、無(wú)創(chuàng )及無(wú)放射性的研究方法，隨著(zhù)儀器的推廣，其在營(yíng)養學(xué)的研究中發(fā)揮著(zhù)重要作用。

4.1 脂肪吸收營(yíng)養學(xué)研究

脂肪的吸收的測定在診斷慢性胰腺炎、囊性纖維化及某些不明原因的慢性腹瀉病人所致脂肪吸收不良具有重要作用。在13C呼氣試驗以前臨床上無(wú)簡(jiǎn)便、可靠并能夠被普遍接受的脂肪吸收的定量方法。以13C呼氣試驗研究正常人脂肪吸收是近幾年新發(fā)展的技術(shù)。以飽和十六碳酸1－13C棕櫚酸（即軟脂酸）為底物，被人體吸收代謝后以13CO2排出體外，用同位素比值質(zhì)譜或氣相質(zhì)譜即可靈敏測定呼出氣中的13CO2變化。以1－13C棕櫚酸為底物是因其在腸道中吸收慢于不飽和脂肪酸，且是人類(lèi)飲食中含量最多的脂肪酸，故棕櫚酸是研究脂肪吸收的理想底物。實(shí)驗已證明13C標記的棕櫚酸在體內的動(dòng)力學(xué)參數與天然棕櫚酸并無(wú)不同，脂解過(guò)程不影響棕櫚酸的吸收，棕櫚酸的吸收可反應總的脂肪吸收情況。

4.2 碳水化合物吸收營(yíng)養學(xué)研究

在以13-C呼氣試驗評價(jià)碳水化合物的吸收時(shí)，一般采用玉米作為底物。玉米是C4植物,其13C豐度較高，根據文獻報道，其δ13C值為－11.9（中國人以C3植物為主要食物，其δ13C為－23.77‰）。玉米中主要成分為淀粉，其含量為69.6%，脂肪及蛋白質(zhì)總含量小于10%，可用其表示糖類(lèi)物質(zhì)的吸收。

5 HPLC-MS/MS臨床營(yíng)養學(xué)研究中的應用

有機質(zhì)譜的種類(lèi)很多，如離子阱質(zhì)譜、四極桿質(zhì)譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜等。近年來(lái)，有機質(zhì)譜中數量增長(cháng)最快、發(fā)展最為迅速、應用最為普及的是與高效液相色譜聯(lián)用的串聯(lián)質(zhì)譜，特別是液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）。HPLC-MS/MS是一種將色譜和質(zhì)譜整合運行的聯(lián)用技術(shù)，以色譜實(shí)現分離，以質(zhì)譜完成檢測，同時(shí)具備了這兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有分離、結構解析同步完成的特點(diǎn)，能直接分析復雜生物基質(zhì)中痕量混合物組分，已經(jīng)成為藥物定量測定和定性分析的核心技術(shù)之一。近年來(lái)，HPLC-MS/MS開(kāi)始應用于營(yíng)養學(xué)，特別是臨床營(yíng)養學(xué)領(lǐng)域的研究，并呈現出迅速增長(cháng)的趨勢。HPLC-MS/MS在臨床營(yíng)養學(xué)中的用途主要體現為：（1）通過(guò)對維生素、氨基酸等營(yíng)養物質(zhì)體內水平的監測，為臨床治療和營(yíng)養支持提供參考；（2）為某些與營(yíng)養素有關(guān)的疾病提供一種新的診斷方法

5.1 維生素的監測

維生素是維持人體健康所必需的營(yíng)養物質(zhì)，分為脂溶性（如維生素A、D、E等）和水溶性維生素（如維生素C、B1、B2、B6、B12等）。維生素具有極其重要的生理作用，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。目前維生素已經(jīng)廣泛用于胃腸內、胃腸外營(yíng)養支持、創(chuàng )傷感染病人的營(yíng)養支持、心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松、糖尿病多種等疾病的治療和輔助治療。因此，正確評價(jià)病人在治療過(guò)程中的維生素水平，對于醫生優(yōu)化治療和營(yíng)養支持方案，提高治療效果具有非常重要的臨床意義。

傳統的維生素體內評價(jià)方法有HPLC、熒光法和免疫反應等，由于維生素的種類(lèi)很多，而且性質(zhì)差異很大，對檢測要求高（穩定性差，必須快速測定。例如，維生素C極不穩定，在－700C冰凍下僅能保存48h[7]；維生素A、D、E需要避過(guò)處理，見(jiàn)光即分解），所以盡管有關(guān)維生素檢測方法的研究已經(jīng)開(kāi)展了很長(cháng)時(shí)間，但目前仍沒(méi)有一種方法能一次性快速測定脂溶性和水溶性維生素，而臨床治療或研究往往需要掌握病人體內多種維生素的情況。所以，當臨床需要同時(shí)監測病人體內多種維生素（如維生素A、D、E和維生素C、B1、B2、B6、B12）水平時(shí)，檢驗人員就被迫采用不同的方法、或不同的檢測條件來(lái)測定同一份標本中的不同種類(lèi)的維生素。根據文獻檢索和臨床反饋來(lái)看，這些方法的樣品處理過(guò)程非常繁瑣，檢測時(shí)間很長(cháng)（以維生素E為例，常用的HPLC方法測定一個(gè)樣本至少需要10-15min），難以對臨床需求做出及時(shí)反饋。而且由于缺少統一的質(zhì)控標準，加上實(shí)驗人員的操作水平不一，所以檢測結果的質(zhì)量也難以得到保證。與傳統的HPLC等分析技術(shù)相比，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法具有前者無(wú)法比擬的檢測優(yōu)勢，靈敏度高、特異性強、測定速度極快，可以一次性同時(shí)定量測定幾十甚至上百種目標分析物，是目前國外公認的進(jìn)行小分子藥物及代謝物定量研究的最先進(jìn)的分析技術(shù)。筆者所在實(shí)驗室近年來(lái)一直致力于將HPLC-MS/MS技術(shù)用于包括維生素在內的多種常見(jiàn)營(yíng)養素的測定工作，并取得了很大進(jìn)展。目前，采用HPLC-MS/MS，在一次測定中實(shí)現對血清\血漿維生素A、D、E、B1、B2、C的同時(shí)測定，對這6種常見(jiàn)維生素的分析一次僅需3min。

5.2 氨基酸的監測

氨基酸是人體必需的營(yíng)養物質(zhì)，許多臨床營(yíng)養學(xué)研究都是圍繞氨基酸來(lái)進(jìn)行的。目前氨基酸作為腸外和腸內營(yíng)養的基本藥品在現代臨床治療上已得到了廣泛應用。為了給臨床用藥和營(yíng)養支持提供可靠的參考資料，準確而快速地測定人體血液中氨基酸的濃度就顯得越來(lái)越重要，因而對測定方法的要求也越來(lái)越高。目前，可用于氨基酸分析的方法有氨基酸分析儀（柱后衍生的離子交換色譜法）、HPLC（柱前衍生化的反相高效液相色譜法）、GC-MS（柱前衍生化的GC-MS法）、HPLC-MS/MS。其中，氨基酸分析儀和HPLC是目前最常用的測定方法。近年，隨著(zhù)HPLC-MS/MS儀器的普及，已經(jīng)有研究人員開(kāi)始開(kāi)展HPLC-MS/MS測定氨基酸的工作。HPLC-MS/MS最大的特點(diǎn)在于能夠利用MS/MS的高選擇性、高靈敏度的功能，對氨基酸無(wú)需衍生化，樣品經(jīng)處理后可以直接測定，分析速度快，因此大大提高了檢測效率。我們實(shí)驗室在2005年建立了可以一次性測定17種游離氨基酸的HPLC-MS/MS方法，血漿/血清樣品以乙腈沉淀蛋白后，直接進(jìn)樣分析，一次測定僅需10min。

5.3 遺傳代謝性疾病的診斷和營(yíng)養支持

遺傳代謝性疾病（Inborn Error of Metabolism，IEM）是一類(lèi)由于基因缺陷引而引起的以功能障礙為主要表現的遺傳性缺陷疾病。遺傳代謝性疾病種類(lèi)繁多，目前得到確認的病種就已經(jīng)超過(guò)500種。IEM疾病臨床表現復雜多樣、診斷較困難。許多患者在新生兒、嬰兒期表現基本正常或僅有一些非特異性癥狀，很易漏診或誤診。另外，迄今多數遺傳代謝病仍無(wú)特殊治療方法，大多數遺傳代謝病以飲食治療為主。因此，對于IEM疾病的防治應遵循早期篩查、早期診斷和早期治療的原則。近年來(lái)，隨著(zhù)HPLC-MS/MS技術(shù)的成熟和發(fā)展，該技術(shù)在IEM疾病的篩查和監測中亦發(fā)揮了很大作用。

HPLC-MS/MS用于遺傳代謝病的篩查診斷，是新生兒篩查史上非常重要的進(jìn)展。歐美等國家已經(jīng)廣泛開(kāi)展了這方面的前瞻性研究，美國FDA在2002年專(zhuān)門(mén)制訂了指導原則對這種技術(shù)在新生兒篩查的應用進(jìn)行規范[8]。

傳統的篩查方法（如Guthrie細菌抑制法）對于氨基酸稀有代謝障礙（如楓糖尿癥）、脂肪酸氧化缺陷（如肉毒堿缺乏癥）、有機酸代謝障礙的檢出率很低。并且一種實(shí)驗僅能檢查一種疾病。以HPLC-MS/MS進(jìn)行篩查和診斷，主要通過(guò)對新生兒干血（或尿）濾紙片中的氨基酸、有機酸、酰基肉毒堿的分析，一次實(shí)驗可以同時(shí)篩查出包括氨基酸病、有機酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷在內的多種遺傳代謝病，真正實(shí)現了從“一種實(shí)驗檢測一種疾病”到先進(jìn)的“一種實(shí)驗檢測多種疾病”的轉變。目前可以采用MS/MS進(jìn)行篩查的IEM疾病有苯丙酮尿癥、中鏈酰基輔酶脫氫酶缺乏癥（MCAD）等40種左右。例如，在一項前瞻性研究中，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對9名患MCAD的患兒的診斷正確率達到了100%[9]。以HPLC-MS/MS對IEM疾病進(jìn)行篩查和診斷的基本流程是：樣本采集（紙片法）、樣本準備（沉淀蛋白后進(jìn)行衍生化）、MS/MS分析（涉及MS/MS的母離子掃描、中性丟失掃描或多反應離子監測等功能）、結果解析。HPLC-MS/MS方法大幅度提高了篩查效率和準確率，降低假陽(yáng)性/假陰性的發(fā)生率，可以對患兒提早進(jìn)行特殊膳食喂養，防止患兒智力損害和猝死。

6 前景

質(zhì)譜技術(shù)在生物、醫藥、環(huán)境監測等許多領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應用，近年在臨床營(yíng)養學(xué)、分子營(yíng)養學(xué)和營(yíng)養蛋白質(zhì)組學(xué)等營(yíng)養學(xué)科中應用呈現逐漸增加的趨勢。該技術(shù)的缺點(diǎn)在于儀器價(jià)格昂貴，檢測費用較高，并且仍存在許多理論和技術(shù)問(wèn)題有待解決。但隨著(zhù)質(zhì)譜特別是生物質(zhì)譜的日益成熟和普及，該技術(shù)在營(yíng)養學(xué)中應用一定會(huì )有非常廣闊的前景。

參考文獻：

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