*2002年中國居民營(yíng)養與健康狀況調查。姬一兵，男，主管醫師，博士研究生。

The application of tracer technique of stable isotope in the study of amino acid physiological requirement

姬一兵 樸建華 楊曉光
（中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 100050）

摘要：本文簡(jiǎn)要綜述了穩定同位素示蹤技術(shù)研究氨基酸生理需要量的研究模型、直接氧化法和指示劑氨基酸氧化法的實(shí)驗原理以及它們在實(shí)驗中的應用，通過(guò)這種方法可以對氨基酸的代謝過(guò)程做一動(dòng)態(tài)觀(guān)察，計算相關(guān)的參數，評估各種必需氨基酸的需要量，所得出的相關(guān)數值均高于世界衛生組織所給出的數值。

關(guān)鍵詞：穩定同位素；氨基酸氧化；生理需要量

Abstract: We introduced the study model of amino acid physiological requirement with stable isotope technique and the principle and application of direct amino acid oxidation and indicator amino acid oxidation.With these methods We might study metabolism kinetics of amino acid, calculate relative parameter, and estimate all kinds of amino acid physiological requirements, the value of amino acid requirements which are calculated by stable isotope technique are obviously higher than that of WHO.

Keywords: stable isotope；amino acid oxidation；physiological requirement

人體內的蛋白質(zhì)由20種氨基酸構成，其中有9種是人體自身所不能合成的，必需直接從外環(huán)境中攝取并經(jīng)過(guò)體內的生理生化反應而合成人體需要的蛋白質(zhì)。氨基酸主要是由碳、氫、氧、氮這四種元素構成的，在自然界中存在的各種元素差不多都有自己的同位素，它們的原子序數相同而原子質(zhì)量不同，化學(xué)性質(zhì)接近，在體內參與相同的生化反應，在對氨基酸的代謝動(dòng)力學(xué)和生理需要量的研究中，利用氮或碳的穩定同位素來(lái)對氨基酸進(jìn)行標記，從而對氨基酸在體內的代謝過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀(guān)察，這樣就可以確定氨基酸的氧化率及吸收利用率，確定氨基酸的流量，通過(guò)特定的計算公式求出人體對氨基酸的需要量。穩定同位素早在20世紀30－40年代就已經(jīng)被學(xué)者于醫學(xué)、生物學(xué)的研究，但是由于其價(jià)格仰貴及檢測過(guò)程復雜而沒(méi)有得到廣泛應用，從20世紀70年代起該方法又重新引起人們的關(guān)注，并被引入到氨基酸需要量的研究中。

1 穩定同位素示蹤技術(shù)的研究模型

1.1 雙庫模型

該模型將人體的氨基酸代謝過(guò)程分為兩個(gè)庫，即游離氨基酸代謝庫和體蛋白質(zhì)庫，蛋白質(zhì)在這兩個(gè)庫之間不斷地合成和分解，保持著(zhù)動(dòng)態(tài)的平衡。根據該模型理論，進(jìn)入游離氨基酸代謝庫的途徑有兩條，一是由食物攝入的氨基酸（I），另一條是由體蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨基酸（C），離開(kāi)這個(gè)庫的途徑也有兩條，一是轉變?yōu)榇x產(chǎn)物（E）而排泄，如脫氨、氧化，最后生成尿素、氨等物質(zhì)，另一個(gè)去路是用于蛋白質(zhì)合成而進(jìn)入體蛋白質(zhì)庫（S）。當機體處于穩定的蛋白質(zhì)和氨基酸營(yíng)養狀態(tài)時(shí)，機體內氨基酸代謝處于平衡狀態(tài)中，即單位時(shí)間內進(jìn)入這個(gè)庫的氨基酸的量與離開(kāi)的氨基酸的量相等：Q＝I＋C＝S＋E，如果單位時(shí)間內進(jìn)出游離氨基酸代謝庫的量以（Q）表示，同時(shí)再測定E和I的值，便可以計算出蛋白質(zhì)的合成速率（S）和分解速率（C），這一模型的確立是以一系列假設為基礎的。其中主要的假設為：1）在實(shí)驗期間代謝庫大小是恒定的2）實(shí)驗期間示蹤原子的再利用可忽略不計3）游離氨基酸代謝庫的消除途徑，除C和E外可忽略或校正[1]。

1.2 α氨基酸的代謝動(dòng)力學(xué)研究

在氨基酸動(dòng)力學(xué)研究中，根據研究的具體要求和目標所采用的標記原子通常為15N和13C，15N標記位置為氨基酸的氨基氮，13C標記的位置通常為氨基酸的羧基[2]。氨基酸在體內的代謝途徑，主要是通過(guò)轉氨基和脫羧基作用，形成α酮酸，進(jìn)而參與重新合成機體氨基酸或者長(cháng)碳鏈分解供能，可以測定氨基酸在機體多個(gè)代謝動(dòng)力學(xué)參數，進(jìn)而描述出各種氨基酸在體內的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。研究中，標記的氨基酸通常通過(guò)靜脈內的方式引入體內，包括靜脈內短期快速推注和恒速輸注[3]。氨基酸在體內脫氨以后生成α酮酸，后者除了進(jìn)一步繼續氧化進(jìn)而燃燒供能以外，仍然有一部分還可以與氨基結合重新形成氨基酸。這一過(guò)程對于研究氨基酸的代謝具有很大意義，例如在研究亮氨酸的代謝過(guò)程中，通常標記羧基碳，求出給予實(shí)驗對象不同水平亮氨酸的氧化率，通過(guò)確定兩相回歸曲線(xiàn)的拐點(diǎn)進(jìn)而求出亮氨酸的需要量。

1.3 穩定同位素示蹤技術(shù)在營(yíng)養學(xué)研究中的優(yōu)越性

避免了放射性同位素對人體輻射的損害，無(wú)環(huán)境污染。

彌補了放射性同位素在種類(lèi)上的不足。如碳、氫、氧、氮等沒(méi)有合適的放射性同位素的元素，可以利用它們的穩定同位素進(jìn)行研究。

利用質(zhì)譜儀，磁共振譜儀等儀器作為穩定同位素標記化合物的測定手段時(shí)，可以同時(shí)測定同位素的豐度和示蹤物的結構，對示蹤原子進(jìn)行定位，從而進(jìn)行代謝研究。

可以進(jìn)行多標記、多重復實(shí)驗。

應用穩定同位素示蹤的方法比常規的氮平衡方法更優(yōu)越，可以動(dòng)態(tài)的觀(guān)察蛋白質(zhì)、氨基酸代謝過(guò)程，深入了解它們的代謝機制。應用穩定同位素示蹤的方法，可以測定人體內蛋白質(zhì)的更新，包括機體內的總體蛋白質(zhì)合成和分解速率，通過(guò)蛋白質(zhì)分解代謝產(chǎn)物來(lái)定量計算[4]

2 氨基酸氧化法（直接氧化法）

通過(guò)給予受試者不同水平的氨基酸受試劑量來(lái)檢測氨基酸的氧化率的變化，進(jìn)而確定機體所需氨基酸的適宜量的一種方法。它是建立在這樣一種理論基礎之上，當機體攝入的某種氨基酸在未達到生理需要量之前，主要用來(lái)合成機體的蛋白質(zhì)，一旦這種氨基酸達到并且超過(guò)了生理需要量，那么超過(guò)的那部分則會(huì )被機體所氧化，從而導致該氨基酸的氧化率迅速升高，在氨基酸氧化率對應氨基酸攝入量水平的量效曲線(xiàn)的拐點(diǎn)處所對應的氨基酸的攝入水平則被認為是該種氨基酸的生理需要量[5]。在該種方法中氨基酸的氧化率的測定使用同位素示蹤的方法，既可以是穩定同位素也可以是放射性同位素，Brookes等首先使用該方法確定大鼠的賴(lài)氨酸需要量，此后，這種方法先后用于大鼠的幾種不同的氨基酸需要量的研究中，Brookes等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗證實(shí)了量效曲線(xiàn)的拐點(diǎn)處所對應的氨基酸的量即是生理需要量，因為他的數據顯示，在低于該水平的氨基酸劑量組中，大鼠停止生長(cháng)而且體重減少，而在高于該劑量的組中大鼠能夠正常生長(cháng)[6]。

穩定同位素示蹤技術(shù)需要對氨基酸代謝庫及分解的終產(chǎn)物進(jìn)行準確的測量，經(jīng)過(guò)標記的碳原子最終將出現在各種不同的代謝產(chǎn)物中，這使得解釋起來(lái)很困難，而且標記的羧基碳不經(jīng)過(guò)呼吸排出而是參與其它的合成反應也是存在的[7]。選擇的標記氨基酸需要滿(mǎn)足三個(gè)條件：1）標記氨基酸必須是必需氨基酸；2）必須是除了氧化分解生成CO2及合成蛋白質(zhì)外不參與其它的有意義的化學(xué)反應；3）標記的羧基碳的氧化反應是不可逆的并且氧化產(chǎn)物能夠定量的計算。美國麻省理工學(xué)院的Young以及他的同事們做了一系列的研究，利用穩定同位素標記羧基碳并測定氨基酸氧化率的變化，確定了亮氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸及蘇氨酸的生理需要量[8]。在他們的研究中，氨基酸流量及氧化率的測量是通過(guò)恒定的靜脈輸注13C標記的氨基酸，當在某一氨基酸攝入水平氨基酸的氧化率驟然增加時(shí)，那么可以認為達到了該氨基酸的生理需要量。他們認為FAO/WHO推薦的蛋白質(zhì)供給量太低[9]。Millard和他的同事們在理論和方法上對Young的結論產(chǎn)生質(zhì)疑[10]，他們認為，1）應用穩定同位素方法所得出的結論由于示蹤劑的稀釋而得出不正確的結果。2）對某一測試水平給予一定的適應期影響了對氨基酸需要量的估計。3）從進(jìn)食狀態(tài)氧化研究中得出的結論是否反映了24h的氨基酸平衡。雖然氨基酸氧化法在確定氨基酸的需要量方面很有價(jià)值，但是由于方法本身的一些缺點(diǎn)，比如示蹤劑稀釋問(wèn)題，還并未被廣泛采用。

近年來(lái)，Vernon Younge及其同事不斷改進(jìn)他們的研究方法，由短期的靜脈輸注測定進(jìn)食狀態(tài)下機體的氨基酸的代謝狀態(tài)，發(fā)展為24h靜脈輸注并且測定受試者進(jìn)食狀態(tài)與禁食狀態(tài)這二個(gè)生理狀態(tài)下的氨基酸動(dòng)力學(xué)變化的各項參數，充分考慮了人體生物節律這一影響人體代謝動(dòng)力學(xué)研究的因素，并考慮了不同人群、各族、環(huán)境等因素，在印度人中做了大量實(shí)驗研究，所得出的結論與早期的短期靜脈輸注研究的結果基本一致[11、12]。

3 指示劑氨基酸氧化法（間接氧化法）

這是一種新近興起的估計人類(lèi)氨基酸需要量的方法，該方法建立在這樣的假設基礎之上，每一種必需氨基酸對膳食中的第一限制氨基酸都是敏感的，當某種必需氨基酸限制蛋白質(zhì)的合成時(shí)，那么其它的過(guò)量的氨基酸必須被氧化，這就是說(shuō)當逐漸增加膳食中限制氨基酸的含量時(shí)，將使其它的膳食氨基酸更多地用于合成蛋白質(zhì)，這樣就減少了它們的氧化，當該限制氨基酸達到生理需要量，這時(shí)如果再增加限制氨基酸的水平也不會(huì )再降低其它氨基酸的氧化，此時(shí)在限制氨基酸攝入水平對應指示劑氨基酸氧化率的量效曲線(xiàn)上，表現為隨著(zhù)限制氨基酸的量的增加，指示劑氨基酸氧化率逐漸下降并且在曲線(xiàn)的拐點(diǎn)后下降不再明顯，說(shuō)明限制氨基酸已經(jīng)達到了生理需要量[13]。指示劑氨基酸氧化法得到了許多實(shí)驗的支持，David C Wilson的實(shí)驗表明，以苯丙氨酸為指示劑確定蘇氨酸的需要量時(shí)，隨著(zhù)蘇氨酸的供給量從不足到足量，苯丙氨酸的氧化率逐漸下降，在達到一定程度后蘇氨酸的量再增加，則苯丙氨酸的氧化率也不再降低[14]。這證明苯丙氨酸可以作為其它氨基酸代謝率的指示劑。

指示劑氧化法在幾個(gè)重要的方面不同于直接氧化法，它可以避免直接氧化法所面對的幾個(gè)問(wèn)題和質(zhì)疑。在直接氧化法中，隨著(zhù)膳食氨基酸濃度的增加所要測定的氨基酸的代謝反應庫的體積也會(huì )增加，相應地會(huì )造成待測定氨基酸濃度降低。而在指示劑氨基酸氧化法中，指示劑與標記和未標記氨基酸的濃度都不會(huì )發(fā)生變化[15]。在Zello等所做的一項人體代謝研究中，隨著(zhù)賴(lài)氨酸攝入量從5mg·kg-1·d-1到60mg·kg-1·d-1，血漿苯丙氨酸濃度、同位素豐度以及苯丙氨酸流量沒(méi)有變化[16]。這些都表明，指示劑氨基酸氧化法能夠克服同位素標記物稀釋的問(wèn)題。該方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可以自由選擇要測試的氨基酸，有一些氨基酸由于其羧基碳不能通過(guò)分解代謝生成CO2因而不能夠使用直接氧化法來(lái)測定，這樣可以使用該方法。只有當一種氨基酸的羧基碳原子能夠發(fā)生不可逆的氧化反應，它才能通過(guò)收集呼吸氣的方法定量的測定。

可以根據氨基酸的代謝特點(diǎn)選擇合適的指示劑，苯丙氨酸、賴(lài)氨酸和亮氨酸都曾經(jīng)被用作指示劑，但后來(lái)發(fā)現亮氨酸在確定必需氨基酸的需要量中并不是一個(gè)很有效的指示劑[17]。苯丙氨酸和賴(lài)氨酸可以很好地滿(mǎn)足作為指示劑的條件，使用13C標記的苯丙氨酸和賴(lài)氨酸作為指示劑可以測定必需氨基酸的需要量[18、19]。使用穩定同位素13C標記苯丙氨酸研究賴(lài)氨酸和色氨酸的需要量，所得出的的結論與直接氧化法相近[20、21]，無(wú)論是直接氧化法還是指示劑氨基酸氧化法所得出的估計值都要比FAO/WHO根據氮平衡法給出的推薦值要高。

綜上所述，穩定同位素示蹤技術(shù)能夠充分反映出蛋白質(zhì)和氨基酸在體內的代謝動(dòng)力學(xué)變化，并可以直觀(guān)的簡(jiǎn)化的模型來(lái)計算各項參數，通過(guò)計算流量、氧化率等指標來(lái)從氨基酸體內的代謝機制上微觀(guān)精確地研究其生理需要量。而且隨著(zhù)穩定同位素檢測技術(shù)的明顯改進(jìn)，該方法的檢測準確性也越來(lái)越高，并且也能夠用于研究蛋白質(zhì)的合成與分解，當前主要有直接氧化法和示蹤劑氨基酸氧化法，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)，在研究氨基酸的需要量中可以互相比較互為參照，隨著(zhù)營(yíng)養學(xué)領(lǐng)域中對氨基酸生理需要量的研究的不斷深入，穩定同位素示蹤技術(shù)一定會(huì )有更為廣闊的應用前景。

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