江驥 毛丹 胡蓓
（中國醫學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫院臨床藥理中心，北京 100730）

1引言

肉毒堿化學(xué)名為β-羥基-γ-三甲基丁酸，廣泛存在于機體組織中。因分子中含有手性碳原子，可以分為L(cháng)和D兩種構型，但只有L構型具有生理活性。本文所指的肉毒堿均為L(cháng)構型。游離肉毒堿與脂肪酸酯化后便生成脂酰肉毒堿。根據酯化的游離脂肪酸碳鏈數目的不同，脂酰肉毒堿又可分為短鏈脂酰肉毒堿（C2-C5）、中鏈脂酰肉毒堿(C6-C12)和長(cháng)鏈脂酰肉毒堿(C14-C18)。

在機體內，長(cháng)鏈脂肪酸必須與肉毒堿酯化為脂酰肉毒堿后才能通過(guò)線(xiàn)粒體膜進(jìn)行β氧化，并且肉毒堿還能與脂酰CoA發(fā)生酰基交換，釋放出游離的CoA。這些過(guò)程需要多種酶的協(xié)調作用才能順利完成。但由于先天性缺陷或某些因素的誘發(fā)使得酶的活性出現異常時(shí)，脂肪酸的代謝便會(huì )出現紊亂。β-氧化受阻可由所涉及的17種蛋白質(zhì)（16種酶和1種轉運蛋白）中的任何一種缺陷造成[1]。

如圖1所示，肉毒堿經(jīng)肉毒堿轉運載體在細胞中被攝取。如果肉毒堿轉運載體缺乏，便會(huì )造成細胞內肉毒堿濃度降低，尿中肉毒堿排出增多。游離脂肪酸在胞質(zhì)中被活化為脂酰CoA，迄今所知，這個(gè)過(guò)程沒(méi)有缺陷。脂酰CoA必須通過(guò)肉毒堿棕櫚酰轉移酶I（CPT I）的作用轉化為脂酰肉毒堿后，才能通過(guò)線(xiàn)粒體內膜。該酶缺乏可導致血漿中游離肉毒堿濃度的相應增高[3]。脂酰肉毒堿跨越線(xiàn)粒體內膜受特殊載體蛋白的影響，這種載體蛋白的缺乏可引發(fā)伴有高氨血癥的嚴重新生兒疾病[2]。附著(zhù)于線(xiàn)粒體內膜內側的是合在一起具有5種酶活性的三種蛋白質(zhì)，它們是：肉毒堿棕櫚酰轉移酶II(CPT II)，超長(cháng)鏈脂酰CoA脫氫酶（VLCAD）及具有長(cháng)鏈3-羥基脂酰CoA脫氫酶（LCHAD）、長(cháng)鏈烯酰CoA水解酶和長(cháng)鏈3-酮酰CoA硫解酶活性的三功能蛋白。嬰兒期這些功能中的任何一種缺陷，便會(huì )表現為心肌病和長(cháng)鏈脂酰肉毒堿的增高，此外還有嚴重的低酮性低血糖。當中鏈脂酰CoA分子從這組線(xiàn)粒體內膜酶中釋放出來(lái)時(shí)，它們便進(jìn)入了β氧化的下一個(gè)循環(huán)中，被進(jìn)一步分解為中鏈和短鏈的脂酰CoA。中鏈脂酰CoA脫氫酶（MCAD）缺乏是歐洲西北部新生兒缺陷中最為常見(jiàn)的一種，具有較高的猝死率。短鏈脂酰CoA脫氫酶（SCAD）常見(jiàn)癥狀為持續性肌張力低下[3,4]。

上述的各種酶缺陷均會(huì )引起血中各種脂酰肉毒堿濃度的相應變化。如轉運載體缺陷會(huì )使游離肉毒堿濃度降低，CPT I缺陷使游離肉毒堿濃度大幅度增加，酰基肉毒堿轉位酶、CPT II、LCAD和VLCAD缺陷使長(cháng)鏈脂酰濃度增加明顯，MCAD和SCAD缺陷分別使中鏈和短鏈脂酰肉毒堿明顯增加。因此，可根據各種酶缺乏所引起的脂酰肉毒堿在血液中濃度的變化情況，為臨床許多與此相關(guān)的代謝性疾病的診斷提供了依據。并且，這類(lèi)分析方法也已經(jīng)被用于某些新生兒先天性疾病篩選以及臨床肉毒堿代謝異常的診斷等。

2 對血漿標本中L-肉毒堿的定量分析方法

目前測定生物基質(zhì)中肉毒堿的方法主要包括酶法、色譜法和質(zhì)譜法等。其中以液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）最為優(yōu)越，這種方法的特異、靈敏、快速、準確等優(yōu)點(diǎn)均得到了廣泛的認可。借助這類(lèi)方法，不僅可以快速、準確定量測定血漿中游離的肉毒堿，也可以區分不同長(cháng)度碳鏈的脂酰肉毒堿并同時(shí)進(jìn)行定量測定。從而使得檢測不同類(lèi)型脂酰肉毒堿的代謝情況成為可能。

在本研究中，我們利用這一方法定量測定了血漿中游離肉毒堿、鹽酸丁酰肉毒堿、鹽酸戊酰肉毒堿、鹽酸癸酰肉毒堿、鹽酸月桂酰肉毒堿、鹽酸棕櫚酰肉毒堿以及鹽酸庚酰肉毒堿等。圖2是典型的血漿中游離的不同長(cháng)度碳鏈脂酰肉毒堿的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜的測定結果。其中的C2-C16是指脂酰肉毒堿中碳鏈的長(cháng)度，IS為用作定量的內標物質(zhì)。

Fig 2Profiles of Carnitin in human sera measured by Tendam Mass spectrometer

對血清中的這些不同類(lèi)型肉毒堿的最低定量濃度分別為5nmol/ml到0.1nmol/ml之間。這個(gè)靈敏度意味著(zhù)通常只需要0.1ml的血液標本就可以滿(mǎn)足定量分析的需要。

3對我國部分正常人和肝硬化、冠心病情況下血清中游離以及不同長(cháng)度碳鏈脂酰肉毒堿情況的檢測
在本研究中，我們分別對健康人以及患有慢性肝、腎功能異常以及冠心病病人血清中血清中游離以及不同長(cháng)度碳鏈脂酰肉毒堿的情況進(jìn)行了初步的檢測（見(jiàn)表1）。

表1研究對象的基本情況

健康人的標準為：不吸煙，不嗜酒。血常規、尿常規、血生化等化驗結果正常，肝、腎功能、心電圖正常，乙肝五項、丙肝、HIV抗體均陰性。病人的診斷均按照北京協(xié)和醫院臨床常規檢查后確診。所有血液標本的獲取均是在清晨空腹狀態(tài)下抽取。

3.1 健康人的數據

Fig1The comparison of free carnitine and
acetylcarnitine between male and female

Fig2The comparison of acylcarnitines between male and female

圖1顯示了健康男性與健康女性血清中FC及C2-CNT的比較，圖2顯示了其它五種脂酰肉毒堿的比較，圖中柱形圖的高度為各物質(zhì)血清中濃度的平均值±標準誤。統計結果顯示：肉毒堿及各種脂酰肉毒堿在男性與女性之間無(wú)顯著(zhù)性差異。

此外，根據對血清中游離肉毒堿及脂酰肉毒堿的濃度與體重指數及年齡的相關(guān)性分析來(lái)看，當P＜0.05時(shí)認為有統計意義。統計結果顯示血清中游離肉毒堿及脂酰肉毒堿的濃度與體重指數及年齡無(wú)相關(guān)性。

3.2 病人與健康人數據的比較

圖3和圖4比較了健康人和病人的測定數據。圖中柱形圖的高度為各物質(zhì)血清中濃度的平均值±標準誤。統計結果顯示：慢性腎衰病人血清中FC和C2-CNT的濃度較健康人顯著(zhù)減少，其它脂酰肉毒堿未見(jiàn)顯著(zhù)差異。冠心病病人血清中FC和各脂酰肉毒堿的濃度與健康人比較無(wú)顯著(zhù)性差異。肝硬化病人血清中的C2-CNT、C12-CNT、C16-CNT的濃度較健康人顯著(zhù)增加（P＜0.05），C4-CNT和C10-CNT的濃度亦有所增加，但未見(jiàn)顯著(zhù)差異。

Fig3The comparison of acylcarnitines
between normal and disease

Fig4The comparison of acylcarnitines
between normal and disease

4 討論

人體所需的肉毒堿主要從日常飲食中獲得，也可在肝臟和腎臟等部位以賴(lài)氨酸和蛋氨酸為原料合成[5]。在某些疾病狀態(tài)下肉毒堿自身合成不足，而此時(shí)又往往無(wú)法進(jìn)行正常飲食，這又造成外源性的肉毒堿補充不足，可導致肉毒堿的缺乏。

有文獻報道肝硬化患者體內肉毒堿濃度異常[6, 7]。由于肝臟是合成肉毒堿的主要部位,而肝硬化病人的肝部已經(jīng)受損,合成能力減弱,又由于食欲減退,使肉毒堿的攝入不足，誘發(fā)肝功能衰竭。有些研究發(fā)現[8]進(jìn)行性肝硬化的肉毒堿嚴重缺乏,只有健康人的25%，尸檢發(fā)現肝硬化患者肝臟、腎臟、肌肉及腦中的肉毒堿水平也只有其他住院患者的1/4到1/3，并且還發(fā)現肝硬化導致的肉堿缺乏病人，20%～60%伴有脂肪肝。但另有研究結果表明[9,10]，肝硬化病人血漿中的游離肉毒堿濃度與健康人無(wú)差別，短鏈和長(cháng)鏈酰基肉毒堿濃度明顯高于健康人（p＜0.01）。為研究肝硬化病人是否存在肉毒堿缺乏現象以及各脂酰肉毒堿濃度是否與健康人存在差別，本研究測定了17名肝硬化病人的血清標本，結果顯示肝硬化病人血清中的游離肉毒堿濃度未見(jiàn)減少，各脂酰肉毒堿濃度高于健康人。

脂肪酸是心肌能量的重要來(lái)源，尤其是饑餓狀態(tài)下，心肌主要依靠脂肪酸的氧化供能[7]。在組織缺氧時(shí)，(氧化成為脂肪氧化的限速步驟[8]，會(huì )引起長(cháng)鏈脂酰CoA在心肌內大量堆積。長(cháng)鏈酰基CoA是肌纖維膜的Ca-ATP酶抑制劑[ 10，11]，造成鈣離子在細胞內堆積。腺嘌呤核苷酸轉移酶（ANT）的活性亦受長(cháng)鏈脂酰CoA的影響[12]，這種酶的功能是將ATP移出線(xiàn)粒體并將ADP移入線(xiàn)粒體，當ANT受到抑制時(shí)，細胞的氧化和磷酸化過(guò)程便會(huì )中斷，使ATP產(chǎn)生減少。高濃度的長(cháng)鏈酰基CoA還會(huì )抑制酰基CoA合成酶，這種酶能夠激活長(cháng)鏈脂肪酸[13]，其受到抑制便會(huì )使脂類(lèi)的代謝發(fā)生紊亂。動(dòng)物試驗表明，缺血心肌內的游離肉毒堿和總肉毒堿的水平均降低，游離脂肪酸及長(cháng)鏈酰基CoA的濃度升高，產(chǎn)生毒性[14]。為研究心臟病人體內肉毒堿濃度的變化，本研究采集了13名冠心病人的血清標本，研究結果表明冠心病人血清中的游離肉毒堿未見(jiàn)減少，而各脂酰肉毒堿均有不同程度增加，但不具有統計學(xué)意義。

有的文獻報道，美國健康男性（2-83歲，n=40）血漿中FC濃度為46.8±10nmol/ml(28-69nmol/ml)，健康女性（2-85歲，n=45）為40.1±9.5(19-60)[15]；歐洲健康人血漿中FC和C2-CNT的正常水平：男性分別為48nmol/ml和5nmol/ml，女性分別為33nmol/ml和3nmol/ml[16]。國內亦有文獻報道，健康男性（28-58歲，n＝10）血漿中FC及C2-CNT 濃度分別為42.5±13.9nmol/ml和7.4±3.1nmol/ml，女性（38-50，n＝10）分別為33.3±10.1nmol/ml和6.2±1.6nmol/ml[15]。由于人種、各國的飲食習慣均不相同，入選人群的年齡構成、樣本量的大小以及測定方法亦有所不同，這些都造成了測定結果的差異。但本研究的數據與前述的中國健康人的數據比較接近。對于各種脂酰肉毒堿，尤其是中鏈和長(cháng)鏈的脂酰肉毒堿的數據國內還未見(jiàn)報道。

參考文獻：

1.N.布勞 M.杜蘭.代謝性疾病實(shí)驗室診斷指南.北京：科學(xué)出版社，2001.

2.Pande S.V. et al (1994)Carnitine-acylcarnitine translocase deficiency: implications in human pathology. Biochim Biophys Acta，1226, 269-276.

3.Amendt B.A. ,Greene. et al Short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency. Clinical and biochemical studies in two patients. J Clin Invest，1987，79,1303-1309.

4.Tein, I. et al Short-chain L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency in muscle: a new cause for recurrent myoglobinuria and encephalopathy. Ann Neurol，1991，30,415-419.

5.Bremer J., Carnitine-metabolism and functions. Physiol Rev，1983，63, 1420-1480.

6. Rudman D, Sewell C W, Ansley J D. Deficency of carnitine in cachectic cirrhotic patients. J Clin Invest, 1977, 60:716-723.

7.Selimoglu MA, Aydogdu S, Yagci RV, Huseyinov A. Plasma and liver carnitine status of children with chronic liver disease and cirrhosis. Pediatr Int Aug， 2001，43(4):391-395.

8.Rudman D, Sewell C W, Ansley J D. Deficency of carnitine in cachectic cirrhotic patients. J Clin Invest, 1977, 60:716-723.

9.D Arienzo, Mazzina. Hypercarnitinemia in cirrhosis. Hepatology，1985，5:343.

10.Pitts BJ, Tate CA,Van Winkle WB: Palmitylcarnitine inhibition of the calcium pump in cardiac sarcroplasmic reticulum: A possible role in myocardial ischemia. Life Sci， 1978，23:391-395.

11.Katz AM, Nash-Adler P, Miceli J: Inhibition of calcium dfflux from the sarcoplasmic reticulum by free acids. Circulation，1979，59(suppl II):12-20.

12.Harris RA,Farmer B, Ozawa T: Inhibition of the mitochondrial adenine nucleotide transport system by oleoyl CoA. Arch Biochem Biophys，1972，1510:199-209.

13.Siliprandi N, Dilisa F, Toninello A: Biochemical derangements in ischemic myocardium: The role of carnitine. G Ital Cardiol，1984，14:804-808.

14.Folts JD, Shug AL: Protect of the ischemic dog myocardium with carnitine. Am J Cardiol，1978，41:1209-1214.