Research Progress on Quantitative Assay of Bifidobacteria

陳津津

（上海交通大學(xué)護理學(xué)院，上海200092）

    摘要：傳統細菌培養計數法是依據細菌表型特征來(lái)對雙歧桿菌進(jìn)行鑒別計數的，MTPY和BSM培養基是經(jīng)常使用的雙歧桿菌培養基。近年來(lái)包括點(diǎn)雜交、熒光原位雜交、熒光原位雜交結合流式細胞計數和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在內的以核糖體及其編碼基因核酸序列為鑒別基礎的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛用于雙歧桿菌的定量定性分析，其中熒光原位雜交結合流式細胞計數和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是目前較為理想的方法。

    關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；定量分析

Abstract：With conventional plating methodologies enumeration and identification of bifidobacteria are based on phenotypic patterns The modified TPY medium(MTPY) and bifidobacteria selective medium(BSM) are often choiced In recent years many of the molecular methodologies which are rooted in the use of ribosomal RNA (rRNA) and its encoding genes have proved to be more accurte,sensitive, take less time and more reproducible rather than conditional plating methodologies Now, a new group of molecular methods such as dotblot hybridization, fluorescence in situ hybridization(FISH), FISH combined with flow cytometry, and realtime quantitative PCR(realtime QPCR) are used for detection, identification and quantification of bifidobacteria in different samples and commercial products The approachs of FISH combined with flow cytometry and realtime QPCR permits the reliable elucidation both qualitatively as well as quantitatively of the abundance of Bifidobacterium spp

Keywords：Bifidobacteria；quantitative assay

    雙歧桿菌（Bifidobacterium）是1899年由法國巴斯德研究所的Tissier首次從母乳喂養的嬰兒糞便中分離發(fā)現的，作為恒溫動(dòng)物腸道內重要的原籍菌群，它與其他生理性細菌成員一起構成了一個(gè)微生物群落，并與宿主構成一個(gè)微生態(tài)系統，發(fā)揮維持微生態(tài)平衡、生物拮抗、免疫調節、營(yíng)養等多方面的生理作用。對人類(lèi)而言，它不僅能維持腸道的微生態(tài)平衡，還能提高人體對乳糖的耐受性，具有降血脂、抗腫瘤的作用，并能合成多種維生素，促進(jìn)機體免疫機能，是最重要的益生菌之一，其在腸道內的總數量反應了機體腸道微生態(tài)狀況和機體的健康狀況。因此對腸道內或食品中的雙歧桿菌進(jìn)行準確地定量分析，對于醫療衛生和營(yíng)養保健方面的研究具有重要意義。雙歧桿菌定量分析的方法主要分為傳統計數法和分子生物學(xué)定量分析法。

    傳統計數法

    細菌培養加菌落計數是雙歧桿菌定性定量的一種傳統計數方法，主要是依據細菌表型特征通過(guò)特殊培養基接種培養、菌株計數而實(shí)現。由于雙歧桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，無(wú)孢子形成，不能游動(dòng)，無(wú)氧化脫氫酶，形態(tài)多變，對酸敏感，對營(yíng)養要求苛刻，其生長(cháng)所需的氮源需有酪蛋白降解產(chǎn)生的肽和氨基酸，所需的碳源大多由人體不能利用的寡糖提供，且與其它乳酸菌如嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌具有相近的生長(cháng)特點(diǎn)，使雙歧桿菌的培養和鑒別存在很大難度。

    當待測樣品中僅含有雙歧桿菌時(shí)，其計數可在葡萄糖血肝培養基（glucosebloodliver,GBL）、強化梭菌培養基（reinforced clostridial agar,RCA）和腦心浸液培養基（brainheart infusion,BHI）等培養基中進(jìn)行［1］。然而大多情況下，待測樣品中往往混合了多種細菌，此時(shí)必須利用選擇性鑒別培養基來(lái)對雙歧桿菌進(jìn)行鑒別計數,各種細菌不同的氧耐受性、營(yíng)養要求、抗生素敏感性以及菌落的形態(tài)和顏色特征構成了鑒別的基礎。在以往眾多的選擇性鑒別培養基中，應用效果較好的主要有：1978年Teraguchi等［2］將新霉素—巴龍霉素—萘啶酮酸—氯化鋰培養基（neomycinparomomycinnalidixic acidlithium chloride,NPNL）用于雙歧桿菌的選擇計數，該培養基在后來(lái)雙歧桿菌計數培養基的發(fā)展中一直作為一種參考培養基。其后，Lapierre等［3］設計的氯化鋰－丙酸鈉培養基（lithium chloridesodium propionate,LP）及Lim［4］研制的葡萄糖—血肝—牛膽汁—慶大霉素培養基（glucosebloodliveroxgallgentamycin,GBLOG），在發(fā)酵乳制品中選擇計數雙歧桿菌時(shí)也得到較好的結果，1991年Chevalier等［5］研究的在半乳糖基質(zhì)（XαGalbased medium）中同時(shí)計數牛奶中的雙歧桿菌及其它乳酸菌的方法也比較好。近年改良的TPY培養基（modified TPY，MTPY）［6］和在MRS培養基中添加鹽酸半胱氨酸的BSM培養基（bifidobacteria selective medium，BSM）［7］因對雙歧桿菌的選擇性較強、培養陽(yáng)性率較高而經(jīng)常使用。以上各種培養基主要是用于食品或發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌菌種的培養，如長(cháng)雙歧桿菌（Blongum）、短雙歧桿菌（Bbreve）、嬰兒雙歧桿菌（Binfantis）、青春雙歧桿菌（Badolescentis）、兩歧雙歧桿菌（Bbifidum）等，而正常人體還包括了一些不能由這些培養基鑒別計數的雙歧桿菌的其它菌種，如球雙歧桿菌（Bglobosum）、鏈雙歧桿菌（Bcatenulatum）、假鏈雙歧桿菌（Bpseudocatenulatum）、角雙歧桿菌（Bangulatum）等,同時(shí)培養基中添加的抗生素對雙歧桿菌本身也會(huì )有不同程度的抑制作用，而且特異性培養基只是相對特異［8］，到目前為止也沒(méi)有一種完全理想的選擇性培養基。這些原因使得傳統的細菌培養法雖然能計數活菌，但費時(shí)、費力、培養難度大，其計數也不精確。

    分子生物學(xué)定量分析法

    傳統細菌培養法的鑒別依據是基于細菌的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特征，而這些特征僅僅是細菌在特殊培養條件下的特異表現，相反分子生物學(xué)定量分析法是以細菌基因組的核酸序列為鑒別基礎，不易受外界環(huán)境因素的干擾，不依賴(lài)培養基性能，不受培養時(shí)間限制，使定量分析結果更穩定、更敏感、更省時(shí)同時(shí)重復性更好［9］。細菌細胞內核糖體數量達104～105，核糖體RNA(rRNA)又具有特異區和保守區之分，因此5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA的指紋圖譜和序列常被用作為比較微生物學(xué)分類(lèi)的方法。其中16S rRNA的序列達1500個(gè)～12000個(gè)核苷酸，其序列長(cháng)度適中，兼有保守區和可變區之分，因此其序列資料常用于設計基因探針和PCR（多聚集鏈反應）擴增引物。由于探針和引物具有高度敏感性和特異性，使其能在屬、種、亞種甚至株等各個(gè)水平上對細菌進(jìn)行鑒別計數。目前用于雙歧桿菌定量分析的分子生物學(xué)技術(shù)主要有點(diǎn)雜交(dot blot hybridization)、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、熒光原位雜交結合流式細胞計數（FISH combined with flow cytometry）和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（realtime quantitative PCR，realtime QPCR）。

    進(jìn)入上世紀90年代后，以16S rRNA為目標基因的寡核苷酸探針雜交技術(shù)被廣泛用于細菌的定性定量分析［10］。該技術(shù)由兩部分組成，1）合成的寡核苷酸探針能與細菌核糖體基因的特殊區域互補雜交，使其具有鑒別的特異性；2）探針末端用特殊物質(zhì)進(jìn)行標記，這些標記物又可分為具有放射活性的熱標，如［32P］ATP、異硫氰酸熒光素（FITC）等，和不具放射活性的冷標，如共價(jià)鍵結合的報告酶或通過(guò)間接標記的半抗原抗體等，然后通過(guò)特定設備對標記物產(chǎn)生的放射活性、熒光數值、酶活性或比色反應數值的測定來(lái)實(shí)現定量的目的［11］。點(diǎn)雜交和熒光原位雜交是主要的兩種用于雙歧桿菌定量分析的寡核苷酸探針雜交技術(shù)。

    Seksik等［12］用6種不同細菌屬的以16S rRNA為目標基因的特異寡核苷酸探針，同時(shí)與克隆病患者糞便中和正常人糞便中提取的RNA進(jìn)行點(diǎn)雜交，發(fā)現克隆病患者組腸道內的雙歧桿菌和梭菌數量、活性較正常人組明顯下降。同樣的技術(shù)也應用于年齡、疾病與相關(guān)腸道菌群結構變化的研究［13］中，研究指出隨年齡的增長(cháng)，腸道內雙歧桿菌的數量、所占比例明顯下降，同時(shí)罹患疾病的風(fēng)險顯著(zhù)增加。Dore［14］、Sghir［15］和Marteau［16］在各自的研究中也用點(diǎn)雜交技術(shù)對雙歧桿菌進(jìn)行了定量。點(diǎn)雜交技術(shù)是以細胞內雜交的rRNA量來(lái)反應細菌數量，其優(yōu)點(diǎn)在于rRNA數量能反應細胞的生理活性，然而不同的細菌細胞內或同一細菌不同生長(cháng)期細胞內所含的rRNA數量有變異，所以用以16S rRNA為目標基因的點(diǎn)雜交進(jìn)行細菌定量只是一種相對定量，其結果具有局限性。針對上述缺點(diǎn)，目前以rDNA即編碼16S rRNA的基因序列為目標基因的點(diǎn)雜交技術(shù)在計數雙歧桿菌時(shí)，避免了核糖體數量變異的影響，取得了較好的效果［17］。

    與點(diǎn)雜交、反斑點(diǎn)雜交和克隆雜交等雜交技術(shù)不同，熒光原位雜交雖然也是以16S rRNA為目標基因，但其無(wú)需提取RNA，而是在待測樣品中直接加入熒光探針，其熒光顯像是以一個(gè)細胞、一個(gè)細胞為基礎，從而可在熒光顯微鏡下對原位細胞內的rRNA量和代謝活性有直觀(guān)了解，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行細菌計數。1995年Langendijk［18］等首次報導了用熒光原位雜交法測定成人腸道細菌數量，發(fā)現雙歧桿菌數量只占細菌總量的2％，遠較以往10％的結論要低。其后由于熒光原位雜交操作方法簡(jiǎn)易、定量精確和檢測敏感特異，而被廣泛用于乳制品［19］和腸道中［20-23］包括雙歧桿菌在內的各種細菌的定量檢測。

    由于熒光顯微鏡下的細菌計數耗時(shí)較長(cháng)，目前又出現了以熒光原位雜交結合流式細胞計數的方法對雙歧桿菌進(jìn)行快速、自動(dòng)的計數。由于該方法結合了FISH的簡(jiǎn)易、直觀(guān)和流式細胞儀計數快捷的優(yōu)點(diǎn)，使它在近幾年內成為醫學(xué)研究實(shí)踐中常用的方法之一。2004年一項抗生素對腸道菌群影響的實(shí)驗室研究［24］和同年Fergus［25］在炎性腸病的研究中都采用了此法對雙歧桿菌進(jìn)行定量分析，取得了較理想的結果。Colum［26］等對益生菌治療腸道感染的研究也提示了相同的結論。

    多聚集鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)的出現雖然只有20年，但它及其衍生技術(shù)已成為分子生物學(xué)實(shí)驗研究最重要的手段之一。在近幾年對雙歧桿菌的各種研究中已涉及PCR、多重PCR（multiplex PCR）、擴增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和熒光實(shí)時(shí)定量PCR（realtime QPCR）等多種PCR技術(shù)。其中realtime QPCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍，并以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點(diǎn)成為雙歧桿菌定量分析的重要方法。2004年Gueimonde［27］等在測定不同年齡正常人糞便中雙歧桿菌的數量時(shí)，分別使用了realtime QPCR和FISH兩種技術(shù)，結果發(fā)現兩者在雙歧桿菌高濃度水平時(shí)都能進(jìn)行精確定量，且結果具有良好的相關(guān)性，而在低濃度水平時(shí)，realtime QPCR的測定更敏感也更精確，其最低檢測水平可達5×104/g。在比較realtime QPCR和點(diǎn)雜交定量糞便細菌的研究［28］中發(fā)現，realtime QPCR的敏感性遠高于點(diǎn)雜交，且操作更簡(jiǎn)易，更快速。Haarman［29］等用realtime QPCR方法進(jìn)行的研究發(fā)現，食用添加益生源配方奶粉的嬰兒，其腸道內雙歧桿菌的總量較食用標準配方奶粉的嬰兒明顯升高，且雙歧桿菌的菌種構成也與母乳喂養的嬰兒相仿。Bartosch等［30］在對老年人腸道菌群結構變化的研究中也使用了realtime QPCR定量技術(shù)，發(fā)現雙歧桿菌等益生菌數量與年齡、飲食和抗生素治療密切相關(guān)。

    可見(jiàn)，從傳統細菌培養法到利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行定量分析，整個(gè)定量分析技術(shù)逐漸向高精確度、高敏感度、高重復性和高效率發(fā)展。

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