Intestinal Microflora and Liver Cirrhosis

葛聲¹ 馬可²

（1 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫院營(yíng)養科，上海200233；2 復旦大學(xué)附屬華山醫院急診科，上海200040）

    近年來(lái)研究發(fā)現，在肝硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腸源性?xún)榷舅匮Y具有重要的作用，兩者互為因果，相互促進(jìn)。腸源性?xún)榷舅刂饕獊?lái)源于腸道菌群的失衡。因此，通過(guò)調整腸道菌群以改善肝硬化患者的癥狀、預防肝硬化并發(fā)癥的發(fā)生等成為研究的熱點(diǎn)［1］。

    正常情況下，肝臟可清除來(lái)自腸道的包括內毒素、氨、吲哚、酚類(lèi)、短鏈脂肪酸、假性神經(jīng)遞質(zhì)前體等各種毒素，還能清除腸源性細菌、真菌等。一旦肝臟功能受到嚴重損傷，腸道的微生態(tài)可發(fā)生顯著(zhù)變化，進(jìn)而腸道屏障功能受損，腸道細菌及其各種代謝產(chǎn)物大量移位進(jìn)入腸外器官，過(guò)度激活機體免疫系統，引起異常免疫反應，導致肝細胞凋亡、壞死。

    1 肝硬化與腸道菌群失調

    人類(lèi)正常腸道菌群包括需氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌，共由30屬500種組成，它們一起形成一個(gè)極其復雜的微生態(tài)系統。腸道菌群與人體相互依存，構成腸道的微生態(tài)系統，該微生態(tài)系統對促進(jìn)食物的消化，產(chǎn)生維生素B1、B2、B6、B12、維生素K、泛酸、生物素、煙酸、葉酸等營(yíng)養物質(zhì)，抵御外來(lái)致病菌的侵入以及刺激免疫系統等方面有著(zhù)重要作用。在腸道的各段中結腸中的細菌濃度最高，其中厭氧菌占絕對優(yōu)勢。回腸末端菌群組成與結腸的接近，厭氧菌數目明顯增多，包括雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌以及革蘭陽(yáng)性球菌等，活菌數達103~107個(gè)/mL。大腸中厭氧菌的數量比需氧菌和兼性厭氧菌高1000~10000倍。其中，優(yōu)勢菌為擬桿菌、雙歧桿菌、真桿菌和消化鏈球菌，亞優(yōu)勢菌為葡萄球菌、乳桿菌、D族鏈球菌和大腸桿菌等。

    正常人腸道菌群的組成在一定時(shí)期內、一定的條件下，保持相對的穩定。在疾病狀態(tài)和應用抗生素的情況下，容易出現菌群失調。曾有研究發(fā)現肝硬化患者的厭氧菌明顯減少，雙歧桿菌、乳酸桿菌所占比例下降，而產(chǎn)氨菌比例上升成為最優(yōu)勢菌。

    國內學(xué)者華靜等［2］對37例肝硬化患者的腸道及18例健康者糞便中8種常見(jiàn)的厭氧菌及需氧菌進(jìn)行定量分析發(fā)現，肝硬化患者雙歧桿菌、真桿菌、擬桿菌數量明顯低于對照組，失去腸道內優(yōu)勢菌地位，而大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等高于正常組成為優(yōu)勢菌。此時(shí)，腸道內處于高度腐敗狀態(tài)，產(chǎn)生的氨、硫化氫、胺類(lèi)、酚類(lèi)等有害物質(zhì)大量蓄積并被人體吸收入血，導致機體各器官、組織受損，肝硬化患者腸道菌群失調，腸粘膜內pH下降，腸腔內pH上升，使有益菌的定植、生長(cháng)、繁殖受到影響。

    2 肝硬化與腸屏障功能障礙

    腸道屏障［3］包括機械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障，這些屏障維護著(zhù)腸道的正常功能。機械屏障由腸道粘液層、腸粘膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構成；化學(xué)屏障由胃腸道分泌的胃酸、膽汁、各種消化酶、溶菌酶、粘多糖等化學(xué)物質(zhì)構成；微生物屏障由腸道常駐菌群的微生態(tài)平衡構成；免疫屏障主要由腸道免疫系統的細胞群構成。

    正常情況下腸道屏障能阻止腸道內細菌及其分解產(chǎn)物經(jīng)腸壁擴散至機體內。肝硬化時(shí)由于小腸血液灌注減少，腸系膜缺血、腸道蠕動(dòng)差，使得致病菌易于繁殖，再加上此時(shí)腸系膜上皮細胞缺血、壞死等，腸屏障受損，通透性增高，失去了對細菌的屏障作用，大量細菌及毒素進(jìn)入組織內。而此時(shí)機體免疫功能又減退，肝臟Kupffer細胞功能受抑制，以及側支循環(huán)的形成使其對內毒素的清除作用下降，致使腸道內毒素得以大量進(jìn)入體循環(huán)［4］。

    肝硬化造成的腸黏膜屏障的損害導致細菌移位發(fā)生［5］，從而造成內毒素血癥及自發(fā)性腹膜炎［6］。“細菌移位”的概念是由Berg等［7］于1979年提出的，即腸道內活的細菌在解剖學(xué)上穿過(guò)腸道黏膜層進(jìn)入腸道固有層，達到腸黏膜淋巴結以及更遠處的器官，如肝、脾和腎等。1990年，Alexander［8］將“細菌移位”的概念擴展為“微生物移位”，即腸道內可存活的或不能存活的細菌及其產(chǎn)物，包括內毒素，通過(guò)解剖學(xué)完整的腸粘膜屏障侵入腸道以外部位的過(guò)程。肝硬化時(shí)，腸道黏膜發(fā)生的超細微變化，腸道黏膜細胞萎縮，腸細胞間緊密連接部位發(fā)生分離和增寬，使細菌及其產(chǎn)物通過(guò)細胞旁通路，進(jìn)入腸系膜淋巴結和門(mén)靜脈循環(huán)，造成細菌移位。進(jìn)入血循環(huán)的內毒素直接損傷腸黏膜上皮細胞，線(xiàn)粒體和溶酶體，并引起腸微血管收縮，使腸黏膜血流量減少，腸組織缺血、缺氧，腸黏膜的屏障功能下降，加劇內毒素的吸收，成為內毒素血癥。細菌移位導致細菌進(jìn)入腹腔以及肝臟庫Kupffer細胞吞噬能力下降等導致宿主機體防御功能低下，增加了患者的感染率，是肝硬化患者常合并自發(fā)性腹膜炎的重要原因。

    3 肝硬化與內毒素血癥

    內毒素是由革蘭氏陰性細胞壁外層的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和蛋白質(zhì)復合而成，通常在細菌死亡后，由細菌壁崩解后釋出。正常情況下，腸源性革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生和釋放的內毒素可以小量、間歇地進(jìn)入門(mén)脈系統，進(jìn)入肝臟后迅速被肝臟Kupffer細胞清除，不會(huì )形成體循環(huán)內毒素血癥。非常低水平的內毒素，對提高機體的免疫功能是有益的。肝硬化時(shí)，由于枯否細胞功能受抑制，肝功能受損，使內毒素清除時(shí)所需的載體al脂蛋白和a1球蛋白減少，肝臟對內毒素的清除和解毒作用降低；肝硬化時(shí)腸道菌群往往失調，致病菌大量繁殖，使內毒素的產(chǎn)生增加；肝硬化門(mén)脈高壓，胃腸道淤血水腫及腸粘膜慢性炎癥的發(fā)生率增高，破壞了腸粘膜屏障，內毒素的吸收增多；肝硬化門(mén)脈高壓，門(mén)-體側支循環(huán)建立，通過(guò)門(mén)-體循環(huán)短路而形成內毒素血癥。故肝硬化時(shí)內毒素血癥的發(fā)生率較高，發(fā)生內毒素血癥后反促肝臟損害。

    LPS入侵機體后首先與血清LPS蛋白結合，然后與細胞表面的CD14分子結合，LPS以L(fǎng)PSLBPCD14復合物的形式活化TLR4信號轉導，通過(guò)TLR4將LPS的信號轉導至細胞內發(fā)揮作用。Toll樣受體4是革蘭氏陰性桿菌脂多糖受體，可激活單核巨噬細胞產(chǎn)生如白介素（IL）1S、重組核因子α、IL6、IL8等促炎因子［9］。LPS可直接誘導肝細胞凋亡，其數量與LPS的量成正比，且在24h內與時(shí)間成正比，早期表現以肝細胞凋亡為特征，晚期則表現為凋亡和細胞壞死同時(shí)發(fā)生。幾乎所有肝硬化患者血清中均有LPS濃度增高。肝硬化患者因腸粘膜機械屏障和免疫屏障功能下降、腸道菌群失調、肝臟對內毒素清除能力下降、內毒素吸收增加和排泄減少等，可造成腸道菌群生長(cháng)過(guò)度和菌群易位，發(fā)生內毒素血癥。反之，內毒素血癥本身又可能直接加重肝臟組織的損傷。動(dòng)物實(shí)驗也發(fā)現肝硬化腹水的形成與內毒素血癥逐漸加重有關(guān)。

    4 微生態(tài)調節劑在肝硬化及其并發(fā)癥治療中應用

    微生態(tài)調節劑是指根據微生態(tài)學(xué)原理，利用對宿主有益無(wú)害的活的正常微生物或促進(jìn)其生長(cháng)的物質(zhì)制成的制劑。分為益生菌、益生元及由益生菌和益生元聯(lián)用組成的合生元。

    微生態(tài)調節劑在肝硬化治療中應用不多，研究包括動(dòng)物實(shí)驗及少量人體試驗。人體試驗證實(shí)補充益生菌可以調節腸道菌群，降低血氨以及內毒素水平。Chiva等［10］為觀(guān)察乳酸菌加抗氧化劑對肝硬化大鼠腸道菌群和細菌易位的影響。將29只采用四氯化碳誘導的肝硬化腹水SD大鼠，分為乳酸菌組、109CFU添加抗氧化劑、維生素C（n=10），vehicle alone(n=11)，水(n=8)灌胃。另外8只非肝硬化的大鼠作為對照組。干預10天后，處死大鼠觀(guān)察回腸、盲腸微生物結構、細菌易位、丙二醛（MDA）水平。結果與采用灌水對照組相比，單獨采用抗氧化劑干預組，以及抗氧化劑加乳酸菌干預組，干預后肝硬化腸球菌、腸桿菌細菌異位(0/11 and 0/10 vs5/8, P＜001)，而且回腸MDA水平明顯降低。提示抗氧化劑或者抗氧化劑聯(lián)用乳酸桿菌可以預防肝硬化時(shí)細菌易位。

    Zhao等［11］將50名肝硬化患者隨機分為兩組，分別口服含有雙歧桿菌、乳酸桿菌及腸球菌的膠囊和含有枯草芽孢桿菌和腸桿菌的膠囊14天，同時(shí)設20名健康對照組。檢測指標包括干預前后腸道6種常見(jiàn)菌菌群改變、糞便pH值、糞氨以及血液中血氨、內毒素的含量。結果發(fā)現與健康對照組相比，肝硬化患者腸道中腸球菌、腸桿菌數量明顯增多，而雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌顯著(zhù)減少。經(jīng)過(guò)14天腸道益生菌干預，與干預前相比，兩組肝硬化患者血氨、糞氨、糞便pH值都顯著(zhù)下降，血液中內毒素水平也明顯下降，服用枯草芽孢桿菌和腸桿菌膠囊的患者干預前后血液內毒素水平差異有統計學(xué)意義（p＜005）。

    由于益生菌能夠降低血氨水平，用于預防輕度肝性腦病方面的研究較多。Liu等［12］給輕癥肝性腦病的患者采用合生元2000進(jìn)行治療，合生元制劑含4種凍干的不產(chǎn)氨細菌（3種乳酸桿菌和一種小球菌各1010 CFU，加可發(fā)酵纖維10g：包括β葡聚糖、菊粉、果膠和抗性淀粉各25g）。55例輕癥肝性腦病的患者隨機分為3組，其中20例使用合生元制劑，20例單用可發(fā)酵纖維，15例用安慰劑。連續干預30天。干預前通過(guò)糞便定量分析發(fā)現肝硬化患者糞便中大腸桿菌和葡萄球菌生長(cháng)增多。使用合生元制劑治療后，這兩種細菌數量減少，不產(chǎn)氨的乳酸桿菌增多，而雙歧桿菌和腸球菌計數不變。證實(shí)合生元2000對降低腸道G細菌有效。停用合生元制劑14天后，乳酸桿菌增多，大腸桿菌和葡萄球菌減少的情況仍存在。用合生元治療后75%患者的糞便pH減低至55以下，單用益生元的患者中也有70%糞便pH低于55，而安慰劑組患者100%糞便pH均大于55。使用合生元制劑治療后50%患者的肝性腦病逆轉。治療前血氨濃度平均為605pmol/L，血漿內毒素濃度平均110pg/ml；治療30天后分別降到386pmol/L和833pg/ml。兩個(gè)治療組患者的血清膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和白蛋白濃度均有好轉，50%患者ChildPugh分級好轉，而安慰劑組無(wú)改變。研究結果提示，改變腸道菌群不僅可以改善肝性腦病，也能改善肝臟疾病，即ALT等指標和ChildPugh分級好轉，說(shuō)明合生元能影響和阻斷肝性腦病發(fā)病機制中某些環(huán)節。

    人體試驗提示益生菌治療可以改善肝硬化患者肝功能指標［13，14］。盡管liu等［12］的研究最初是為研究合生元2000在治療輕癥肝性腦病中的作用，研究同時(shí)也揭示了經(jīng)過(guò)1個(gè)月的治療，經(jīng)過(guò)隨機分組而采用合生元2000治療的患者中47%患者肝臟ChildPugh分級好轉，而在采用可發(fā)酵纖維治療組只有29%患者有改善，安慰劑組只有8%患者有改善，主要表現在血清白蛋白、膽紅素和凝血酶原方面。作者推測，血清內毒素水平的下降與肝臟合成功能改善有關(guān)。

    另一項研究比較了補充益生菌和益生元對肝硬化患者的治療作用。Riordan等［15］用補充G+腸道菌群調節合生元：11個(gè)患者進(jìn)入實(shí)驗，包括酒精性7人，丙肝3人，原發(fā)膽源性肝硬化1人；其中Childpugh分級A級7人，B級2人，C級2人，口服凍干G+腸道菌群調節劑，應用不同的益生菌，胚芽乳酸桿菌2362，乳酸菌亞支19等。每個(gè)膠囊的細菌濃度為4×1010CFU（colony forming units），以及10g生物活性纖維含β葡聚糖25g、菊糖25g、果膠25g及抗性淀粉25g）（合生元2000）。病人每天給予2次，每次1粒膠囊，共7天。在干預前和干預過(guò)程中病人不給予乳果糖。檢測外周血單核細胞（PBMCs）TLR2的表達、血清TNFa水平，以體外外周血單核細胞對SEB（葡萄球菌腸毒素）的刺激產(chǎn)生的TNFa的水平為判斷基線(xiàn)。補充7天、28天后，作為對照組5例沒(méi)有癥狀的志愿者不給予腸道菌群調節劑，在3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行TLR2的分析為標準。結果口服益生菌和益生元治療7天后，TLR2表達顯著(zhù)增加，而停藥28天后又逐漸降低接近治療前水平。治療7天時(shí)TNF濃度增加，可能說(shuō)明內毒素和其他細菌刺激對TNF生成的重要意義。上述結果提示，補充合生元7天后腸道中G+細菌增加，導致周?chē)袉魏税准毎腡LR2和血清TNF增加，為進(jìn)一步研究TLR2在用合生元治療肝臟炎癥和纖維化中的作用提供了線(xiàn)索。

    5 展望

    腸道微生態(tài)研究顯示，肝硬化的并發(fā)癥如細菌感染、肝性腦病等病癥的發(fā)生發(fā)展中腸道菌群起了非常重要的作用，調整腸道菌群微生態(tài)可作為輔助治療的手段［16］。應用益生菌和益生元或許可以改善臨床病情較輕的慢性肝病和肝硬化患者的臨床前景。微生態(tài)調節劑的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)毒副作用，但是療效還不夠顯著(zhù)，這可能與微生態(tài)制劑種類(lèi)的選擇、進(jìn)入體內的有效活菌數等因素有關(guān)。迄今為止，有關(guān)肝硬化患者腸道菌群的結構變化與其功能關(guān)系研究相對較少，臨床試驗規模較小，相關(guān)研究大多以動(dòng)物實(shí)驗為主，今后需要加強微生態(tài)制劑所用菌種的篩選研究，進(jìn)行較大規模的臨床肝硬化腸道微生態(tài)干預研究，以確定微生態(tài)調節劑防治肝硬化的作用。關(guān)于益生菌治療的安全性問(wèn)題、對全身的影響以及與抗生素聯(lián)用等問(wèn)題都將有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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