學(xué)術(shù)報告廳
中國絕經(jīng)后婦女亞甲基四氫葉酸還原酶C677T多態(tài)性與骨折風(fēng)險的關(guān)系
Xiumei Honga,b,dYi-Hsiang HsucHenry TerwedowcGenfu TangdXue LiudShanqun Jiangd Xin XucXiping Xua,b,d（a 中國科技大學(xué)生命科學(xué)院；b 美國芝加哥伊利諾斯大學(xué)公共衛生學(xué)院流行病學(xué)與生物統計學(xué)部群體遺傳學(xué)中心；c 美國波士頓哈佛公共衛生學(xué)院群體遺傳學(xué)項目；d 安徽醫科大學(xué)醫學(xué)研究所）
王勁譯自Bone, 2007, 40(3)∶737-742.
摘要：骨質(zhì)疏松性骨折是老年人群殘疾和間接死亡的最主要原因。以前的研究顯示，同型半胱氨酸水平和編碼亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）的基因C677T多態(tài)性可能涉及歐洲人群骨質(zhì)疏松的形成及其相關(guān)骨折。本研究的目的是確證1899名中國絕經(jīng)后女性的多態(tài)性與骨礦物質(zhì)密度（BMD）和骨折間的關(guān)聯(lián)。該人群C677T基因的T等位基因是392%。MTHFR的基因型分布遵循HardyWeinberg平衡定律。T等位基因攜帶者傾向于患骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少癥的風(fēng)險較高，但統計學(xué)差異不明顯。然而，Poisson回歸分析揭示，T等位基因攜帶者絕經(jīng)前后的骨折風(fēng)險增加（RR=17，95%CI=11～27，p=001）。就絕經(jīng)后骨折發(fā)生率而言，CT或TT基因型是CC基因型風(fēng)險的2倍以上（RR=25，95%CI=12～49，p=0009）。該關(guān)聯(lián)獨立于年齡、體力活動(dòng)、職業(yè)、被動(dòng)吸煙、身高、體重、絕經(jīng)后年限和整個(gè)髖部的BMD。
我們的資料顯示，MTHFR C677T基因多態(tài)性是骨折風(fēng)險的獨立預測因子，盡管其對BMD僅有微弱的作用。進(jìn)一步對該基因多態(tài)性在骨折形成中所起作用的機制研究可以使我們更好地了解骨質(zhì)疏松性骨折的病因學(xué)。
引言
骨質(zhì)疏松是一種普通的代謝性骨病，其特征以骨量下降、骨骼脆性下降和骨組織微觀(guān)結構破壞，最終引起骨折增加。骨質(zhì)疏松性骨折是老年人群殘疾和間接死亡的最主要原因。30%女性和12%男性在生命某一刻受其影響，因此，對社會(huì )造成了嚴重的經(jīng)濟負擔。
同型半胱氨酸是含硫醇的氨基酸，形成于蛋氨酸代謝中。最近，幾方面證據指出高同型半胱氨酸水平涉及骨質(zhì)疏松和骨折的病理學(xué)。首先，高半胱氨酸尿癥是罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳疾病，是以同型半胱氨酸循環(huán)血水平升高和骨質(zhì)疏松及骨折早發(fā)為特征。其次，在動(dòng)物研究中，與對照組小雞相比，喂飼添加同型半胱氨酸飼料的小雞，骨骼生長(cháng)、骨基質(zhì)和骨成分發(fā)生了改變。第三，最近，來(lái)自2個(gè)隊列研究的資料顯示，總同型半胱氨酸血漿水平與骨質(zhì)疏松性骨折呈正相關(guān)。此外，在NHANES Ⅲ研究中，同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的男女性髖部BMD明顯低于同型半胱氨酸水平＜10μmol/L的個(gè)體。
一般認為，包括510亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）等幾個(gè)酶在同型半胱氨酸代謝中起重要作用。MTHFR基因（C677T）點(diǎn)突變，引起纈氨酸置換丙氨酸，是一個(gè)與酶活性下降和同型半胱氨酸水平升高有關(guān)的共同變量。一些研究報道，該基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折或低BMD風(fēng)險增加有關(guān)。然而，其他研究未能確證這種關(guān)聯(lián)。例如，Jorgensen等報道MTHFR C677T基因多態(tài)性的雜合子或純合子絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險均下降。相反，Golbahar等發(fā)現該基因多態(tài)性與伊朗女性股骨頸或腰椎BMD沒(méi)有關(guān)聯(lián)。這些研究結果的差異可能部分由于研究人群的不同，如種族、年齡、環(huán)境和遺傳修飾。
本研究，我們調查了2003～2005年中國安徽省社區骨質(zhì)疏松研究中的一個(gè)絕經(jīng)后女性抽樣人群。評價(jià)該抽樣人群的MTHFR C677T基因多態(tài)性對整個(gè)髖部、全身和股骨頸的BMD以及骨折風(fēng)險的作用。
材料與方法
研究人群
該研究是始于2003年社區骨質(zhì)疏松研究中的一部分，以前描述過(guò)。簡(jiǎn)而言之，在中國安徽省男女性中納入年齡在25～64歲和至少3名參與的同胞。排除以下病史的參與者，包括Ⅰ型糖尿病、腎衰、結核病或其他慢性傳染病、惡液質(zhì)、佝僂病或其他代謝性骨病。自述停經(jīng)1年以上并無(wú)外科手術(shù)史（子宮或卵巢切除）及妊娠或哺乳的女性被認為是絕經(jīng)后女性。本研究?jì)H對無(wú)吸煙史的女性進(jìn)行基因分型和分析。7名服用鈣和/或多種維生素補充劑累積達或超過(guò)6個(gè)月的絕經(jīng)后女性，以及5名絕經(jīng)后有雌激素治療史的女性也被剔除。最終，本研究獲得2245名絕經(jīng)后女性。本研究方案得到了哈佛公共衛生學(xué)院人類(lèi)對象委員會(huì )（制度審查委員會(huì )，IRB）和安徽醫科大學(xué)倫理委員會(huì )的批準。向每位參與者解釋知情同意書(shū)，并讓他們閱讀和簽名。
BMD測量和骨折識別
采用雙能X線(xiàn)吸收測量術(shù)（DXA，GELunar Prodigy, Madison, WI）通過(guò)掃描全身和整個(gè)髖部測量骨礦物質(zhì)含量（BMC）和BMD（g/cm2）。整個(gè)髖部BMD低于同一研究地區青年健康中國人平均BMD峰值25個(gè)標準差以上（Tscore＜-25）者診斷為骨質(zhì)疏松。整個(gè)髖部BMD低于峰值BMD1～25個(gè)標準差則定為骨質(zhì)減少。
采用問(wèn)卷調查收集骨折信息。記錄骨折頻率、骨折部位及參與者第一次和最后一次骨折的年齡。本次調查僅分析第一次骨折史。為了增加統計效力，文件證明任何部位的第一次骨折均作為測量結局。然而，鑒于手、足、頭骨和面部骨折不被認為是骨質(zhì)疏松事件而被排除。
可能的混雜因子
脫鞋，在精度01cm的測距儀上測量身高及在室內開(kāi)燈著(zhù)內衣測量體重（精度為01kg）。體重/身高2（kg/m2）計算體質(zhì)指數（BMI）。通過(guò)標準化問(wèn)卷收集參與者的性別、生日、病史、職業(yè)、體力活動(dòng)水平及月經(jīng)和生育史（包括初潮年齡、上次月經(jīng)的日期和HRT史等）。采用膳食調查問(wèn)卷收集每位參與者的地方食品條目/種類(lèi)，如主食（主要是大米）、牛奶、海產(chǎn)品、罐頭食品、肉類(lèi)（主要是豬肉）、水果和蔬菜。
SNP基因分型
收集參與者的空腹靜脈血樣，并且通過(guò)標準化鹽析過(guò)程提取淋巴細胞中的基因組DNA。采用聚合酶鏈反應進(jìn)行MTHFR C677T基因分型，引物是5CAA AGG CCA CCC CGA AGC3（有意義鏈）和5AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG3（反意義鏈）。樣品擴增35個(gè)循環(huán)，包括94℃30分鐘變性、59℃45秒退火和68℃45秒延長(cháng)、最后68℃7分鐘延長(cháng)。由于第677核苷c轉換成t產(chǎn)生了HinfI的消化位點(diǎn)，核酸內切酶能夠將突變限制位點(diǎn)的擴增產(chǎn)物分解成175bp和70bp片段，而野生型基因不被分解。消化產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳分離。基因分型后，獲得1899名研究對象DNA樣本，最后分析有全部基因分型者的資料。有全部基因分型者和沒(méi)有基因分型者的主要特征沒(méi)有顯著(zhù)性差異。
統計方法
本研究主要結局是骨質(zhì)疏松/骨質(zhì)減少和骨折發(fā)生。調整年齡、身高、體重、體力活動(dòng)、被動(dòng)吸煙和絕經(jīng)年限等的多元線(xiàn)性GEE回歸模型用于檢驗全身、整個(gè)髖部、股骨頸等部位BMD與MTHFR C677T基因分型間的關(guān)系。調整年齡、身高、體重、體力活動(dòng)、被動(dòng)吸煙和絕經(jīng)年限等的多元logistic回歸模型用于估計該基因多態(tài)性對骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少的獨立風(fēng)險。
采用2個(gè)結局變量計算第一次骨折的發(fā)生率。第一個(gè)變量是絕經(jīng)前后所有骨折的發(fā)生率，采用從生日至第一次骨折日或資料收集日間的風(fēng)險累積人年數表達。第二個(gè)變量是絕經(jīng)后第一次骨折發(fā)生率，采用絕經(jīng)年齡至第一次骨折日或資料收集日間的風(fēng)險累積人年數表達。分析第二個(gè)變量時(shí)，排除了57名第一次骨折發(fā)生在絕經(jīng)前的研究對象。
調整年齡、身高、體重、體力活動(dòng)、職業(yè)、被動(dòng)吸煙、絕經(jīng)年限和整個(gè)髖部BMD的Poisson回歸用于計算按MTHFR C677T基因型分類(lèi)的骨折風(fēng)險比例及其95%可信區間。
進(jìn)一步使用膳食變量（如每周海產(chǎn)品、水果和肉類(lèi)等消費量）作為B族維生素/葉酸等攝入量的代理標志物，并通過(guò)增加乘積項進(jìn)入模型，檢驗了每種膳食變量與MTHFR基因型間的對BMD和骨折的交互作用。
結果
在1899名絕經(jīng)后研究對象中，C677T等位基因頻率符合HardyWeinberg平衡定律（X 2=37，p=006）。基因型分布是：CC，CT和TT分別是359%、498%和143%。每種基因型的人群特征列于表1。連續性變量采用ANOVA檢驗，而分類(lèi)變量采用X 2檢驗比較基因型間這些特征的差異。除了TT基因型重體力活動(dòng)百分比相對低以外，這些人群特征在基因型分類(lèi)間沒(méi)有顯著(zhù)性差異。有關(guān)膳食資料，我們發(fā)現以周為基礎，981%的對象蔬菜消費超過(guò)1500g，991%的對象牛奶飲用低于250g，774%的對象魚(yú)類(lèi)消費低于250g，591%的對象罐頭食品消費超過(guò)250g，823%的對象水果消費低于250g，且683%的對象肉類(lèi)消費低于250g。按基因型分組，食物頻率分布比較用X 2檢驗（p＞005）。
MTHFR基因分型、骨礦物質(zhì)密度和骨質(zhì)疏松
正如圖1所示，不同MTHFR C677T基因型間平均的全身、整個(gè)髖部和股骨頸的BMD沒(méi)有差異。調整多元回歸模型中年齡、體力活動(dòng)、職業(yè)、被動(dòng)吸煙、身高、體重和絕經(jīng)后年限等變量后，MTHFR C677T基因多態(tài)性仍然與每一骨骼部位的BMD沒(méi)有顯著(zhù)相關(guān)性（資料未顯示）。
正如表2所示，T等位基因攜帶者患骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)減少/骨質(zhì)疏松趨于較高風(fēng)險，但是相關(guān)性沒(méi)有統計學(xué)顯著(zhù)性(p＞005)。
MTHFR基因分型和骨折
109名研究對象自述髖部、脊椎、腕、臂、腿、踝或骨盆等部位有骨折，并納入分析中。平均第一次骨折年齡是417±132歲。絕經(jīng)后發(fā)生了52例骨折事件。按基因型分層的骨折類(lèi)型分布見(jiàn)表3。通常，各基因型中主要骨折類(lèi)型是腕部骨折。CC或CT基因型傾向于與骨折或絕經(jīng)后骨折較高發(fā)生率有關(guān)。
與CC基因型對象比較，調整年齡、體力活動(dòng)、職業(yè)、被動(dòng)吸煙、身高、體重、絕經(jīng)年限和整個(gè)髖部BMD等，則CT和TT基因型對象的骨折相對危險度（RR）分別是17（95%CI=11～27，p=002）和19（95%CI=11～33，p=002），攜帶T等位基因對象的骨折RR是17（95%CI=11～27，p=002）。就絕經(jīng)后第一次骨折發(fā)生率而言，MTHFR C677T基因型也表現出明顯的T等位基因顯性效應。T等位基因攜帶者相對于CC基因型攜帶者，其絕經(jīng)后骨折發(fā)生率增加至25倍（95%CI=12～49，p=0009），見(jiàn)表4。
此外，我們利用代表B族維生素/葉酸攝入量的膳食變量作為代表標志物，并檢驗膳食變量和MTHFR基因型對BMD和骨折的交互作用，但沒(méi)有檢驗出顯著(zhù)的交互作用(資料未顯示)。
討論
我們的資料表明，MTHFR C677T基因型對絕經(jīng)后中國女性骨折風(fēng)險有顯著(zhù)和獨立的效應。CT或TT基因型增加絕經(jīng)前后骨折發(fā)生的風(fēng)險。T等位基因攜帶者相對于CC基因型攜帶者，其絕經(jīng)后骨折發(fā)生率增加至25倍。
MTHFR C677T等位基因頻率在世界不同的地區和民族間有很大的變異。該等位基因頻率在西非人是009，在加拿大因紐特人是006，而白種人、日本人和中國人群的頻率要高很多。在歐洲觀(guān)察到C677T等位基因頻率自北向南升高。相反，在中國報道，TT基因型自北向南減少。更為有趣的是，MTHFR基因型分布可能改變其對血漿同型半胱氨酸的效應。所有這些結果強調了研究不同人群中該基因多態(tài)性影響作用的重要性。本研究中，研究對象來(lái)自中國中南部。TT基因型和T等位基因頻率分別是143%和392%，這與中國該地區以前研究相當。中國人群T等位基因和TT基因型的高頻率表明，MTHFR C677T多態(tài)性的歸因危險度可能要高于許多以前報道的研究中所見(jiàn)的危險度。
絕經(jīng)后的日本女性顯示MTHFR TT基因型與低腰椎和全身BMD間有顯著(zhù)性關(guān)聯(lián)。以前中國的研究或本次研究不能確證該關(guān)聯(lián)，盡管我們發(fā)現TT基因型趨于骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)減少的高風(fēng)險，但統計學(xué)不顯著(zhù)。對該差異的解釋可能在于營(yíng)養因素攝入量的不同，如核黃素、B6、B12和葉酸，這些都是同型半胱氨酸代謝所必需的。最近一項蘇格蘭女性隊列研究表明，僅在核黃素攝入量低時(shí)，TT基因型對象的BMD下降。因此，營(yíng)養因素可能是MTHFR多態(tài)性與BMD之間關(guān)聯(lián)的混雜因素。在我們的研究中，采集了自述藥物治療史（口服避孕藥、激素替代療法 \[HRT\]）、鈣、維生素D和多種維生素補充劑等）。僅7名對象鈣和/或多種維生素補充劑使用累積達到或超過(guò)6個(gè)月，并且均被剔除。綠葉蔬菜（像菠菜和蕪菁綠葉）、水果（如柑桔類(lèi)水果和果汁）、干豆和豌豆等均是葉酸的天然來(lái)源。盡管B族維生素存在于許多食品中，但它們脆弱易被破壞，尤其易被酒精和烹調破壞。食品加工也會(huì )丟失B族維生素，如生產(chǎn)的精白面粉、面包和大米比其全谷類(lèi)原料的營(yíng)養價(jià)值要低。盡管通過(guò)簡(jiǎn)單的問(wèn)卷采集了參與者局部食品的消費量，如牛奶、海產(chǎn)品、罐頭食品、肉類(lèi)、蔬菜和水果等，但由于問(wèn)卷的屬性，無(wú)法定量每日膳食的B族維生素或葉酸的攝入量。然而，我們研究隊列中的主要食物來(lái)源有限，且參與者膳食攝入量相對一致。按基因分型，本研究膳食變量分布是均衡的。這些膳食變量也被用于B族維生素/葉酸攝入的代表性標志物，并且估計它們與MTHFR基因型對BMD和骨折的交互作用效應，但未發(fā)現顯著(zhù)的交互作用。
237名病例和200名年齡匹配的對照的丹麥病例-對照研究描述了TT基因型相對于聯(lián)合CC/CT基因型的骨質(zhì)疏松性椎骨骨折的比值比（OR）是193。另一項丹麥前瞻性研究隨訪(fǎng)了1748名絕經(jīng)后婦女。后者，經(jīng)受骨折的42名對照組婦女和10名HRT處理組婦女納入分析，絕經(jīng)后前5年骨折發(fā)生率在TT基因型的對照組中增加至2倍以上（RR=26）。與這2項研究一致，我們發(fā)現TT基因型研究對象絕經(jīng)后骨折發(fā)生率的風(fēng)險高出23倍。這種關(guān)聯(lián)不依賴(lài)于年齡、絕經(jīng)年限、體力活動(dòng)、職業(yè)、被動(dòng)吸煙、目前酒精消費量和整個(gè)髖部BMD。然而，我們也發(fā)現CT基因型對骨折風(fēng)險的作用類(lèi)似于TT基因型作用的強度，因此，表明MTHFR C677T多態(tài)性表現的是對骨折風(fēng)險的T等位基因顯性模型。鑒于這些結果，MTHFR C677T基因型在骨質(zhì)疏松性骨折形成中可能起獨立的作用。
MTHFR C677T多態(tài)性與骨折風(fēng)險間關(guān)聯(lián)的機制不清楚。然而，我們推斷T等位基因攜帶者骨折風(fēng)險增加不是主要由BMD介導的。眾所周知，MTHFR C677T多態(tài)性與同型半胱氨酸水平增加相關(guān)。高同型半胱氨酸水平可能在骨折風(fēng)險中起作用。正如丹麥研究中所示，同型半胱氨酸水平處于最高四分位數的對象與處于其他3個(gè)四分位數的對象相比，非椎骨骨折風(fēng)險隨同型半胱氨酸水平升高而增加。Framingham研究報道了婦女同型半胱氨酸水平升高與髖骨骨折發(fā)生率間的類(lèi)似關(guān)聯(lián)強度。盡管高同型半胱氨酸水平導致骨折的機制還未確定，但一些資料表明，它可能干擾了膠原橫向連接并導致骨基質(zhì)改變而形成更多的脆性骨骼。我們假設MTHFR C677T多態(tài)性可能通過(guò)升高同型半胱氨酸水平干擾骨微觀(guān)結構形成，這不依賴(lài)于骨中礦物質(zhì)數量。
MTHFR C677T多態(tài)性可能存在通過(guò)改變DNA甲基化而對骨骼起間接作用。DNA甲基化是關(guān)鍵的表觀(guān)遺傳學(xué)機制，它包括染色質(zhì)修飾的開(kāi)始和基因表達的調節。DNA異常甲基化被認為在許多疾病的促進(jìn)中起重要作用。最近，幾個(gè)報告顯示，MTHFR C677T基因型攜帶者DNA甲基化明顯減少。這個(gè)過(guò)程可能涉及同型半胱氨酸相關(guān)的血管疾病和腫瘤的病理學(xué)。需要進(jìn)一步研究確定是否由MTHFR C677T多態(tài)性引起的DNA甲基化能夠影響骨折發(fā)生率。
對該觀(guān)察到的關(guān)聯(lián)的另一個(gè)解釋是：并不是MTHFR基因本身中的MTHFR C677T多態(tài)性增加骨折風(fēng)險，而是鄰近與該多態(tài)性基因不均衡連接的基因造成的。據報道，賴(lài)氨酸羥化酶1（LH1）基因的突變與LH1活性下降及導致減弱膠原交聯(lián)有關(guān)，該基因位于染色體1上距MTHFR基因150kb處。
本研究存在幾個(gè)局限性。首先，它是一個(gè)回顧性研究，并且存在不能排除的回憶錯誤偏倚。第二，此處所研究的骨折事件是自述的且由當地醫生診斷。沒(méi)有進(jìn)一步的確證診斷而不能完全區分骨質(zhì)疏松性骨折和高能量外傷引起的骨折。第三，鑒于膳食資料的局限性，仍然不能完全排除MTHFR C677T多態(tài)性可能與B族維生素和/或葉酸交互作用的可能性。因為葉酸和維生素B6和B12是同型半胱氨酸濃度的主要決定因子，這些維生素中一種或多種不足可更改同型半胱氨酸對骨表型的影響作用。需要進(jìn)一步研究解決這個(gè)問(wèn)題。
總之，我們發(fā)現MTHFR C677T多態(tài)性在預測骨折風(fēng)險上起獨立作用。需要進(jìn)一步研究闡明MTHFR C677T多態(tài)性對骨折形成影響的機制。識別這種機制可能有助于更好地了解骨質(zhì)疏松癥和未來(lái)骨質(zhì)疏松性骨折的病因學(xué)，并且可導致早期預防、識別和處理策略的改善。