穩定同位素技術(shù)及其在鈣營(yíng)養相關(guān)研究中的應用
Application of Stable Isotope Techniques in Calcium Nutrition

何國鵬綜述蘇宜香審校

（中山大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養系，廣州510080）

摘要：近年來(lái)，隨著(zhù)穩定同位素技術(shù)的發(fā)展，其在鈣營(yíng)養相關(guān)研究中得到了較廣泛的應用，尤其多用于兒童青少年、孕婦和乳母的鈣營(yíng)養研究中。本文對穩定同位素技術(shù)及其在鈣營(yíng)養研究中應用的相關(guān)文獻進(jìn)行了綜述。
    足夠的鈣攝入對于維持機體健康及預防疾病如骨質(zhì)疏松癥是非常重要的，這不僅因為鈣是骨骼和牙齒的主要構成成分，參與骨代謝\[1\]，而且其在維持機體多種組織細胞和生物大分子的正常功能方面也發(fā)揮著(zhù)重要作用\[2\]。長(cháng)期以來(lái)，鈣營(yíng)養相關(guān)研究多是通過(guò)傳統的平衡試驗來(lái)進(jìn)行，然而這種試驗由于研究時(shí)間太長(cháng)通常不易為人們所接受，這種情況在兒童中尤為明顯\[3,4\]；此外，平衡試驗不能區分未吸收鈣和內源性分泌鈣，故只能計算鈣的表觀(guān)吸收率，不能進(jìn)行鈣動(dòng)力學(xué)研究，也很難評價(jià)營(yíng)養素間的相互作用。近年來(lái)的研究發(fā)現，在鈣需要量增加的特殊生理時(shí)期如生長(cháng)期、孕期和哺乳期，機體對鈣的吸收和代謝會(huì )發(fā)生一系列生理變化\[4~6\]，而這一系列變化間的相互關(guān)系用傳統的平衡技術(shù)已經(jīng)難以解釋。上個(gè)世紀40年代，放射性同位素鈣（45Ca和47Ca）開(kāi)始被廣泛地應用于成人鈣的吸收和代謝研究中\[7\]，但是由于其存在潛在的安全性和倫理問(wèn)題，故這種方法極少用于兒童和孕婦的研究。穩定同位素技術(shù)誕生后，由于其方法安全、準確并且相對簡(jiǎn)單，近年來(lái)在鈣的吸收和代謝研究中逐漸得到了應用，尤其在特殊生理人群（兒童、孕婦和乳母）的鈣吸收和代謝研究中更是成為首選的方法\[3\]。本文介紹了近年來(lái)穩定同位素技術(shù)及其在鈣營(yíng)養相關(guān)研究中的應用情況，同時(shí)對其在以后研究中的應用方向作了展望。

1.穩定同位素技術(shù)

1.1 穩定同位素種類(lèi)的選擇

    穩定同位素是自然界存在的、無(wú)放射性的同位素。純化的鈣穩定同位素在人類(lèi)研究中使用是安全的\[8\]。已知鈣在自然界中有40Ca、42Ca、43Ca、44Ca、46Ca、48Ca 6種穩定同位素,它們在自然界中存在的天然豐度(相對含量)是恒定的,分別為961941%、01647%、01135%、21086%、01004%、01187%\[7\]。由于穩定同位素具有不同的天然豐度（噪聲水平），因此為了獲得相同水平的信噪比（△%，△%＝（Ca樣品－Ca自然）/Ca自然），試驗所使用穩定同位素的劑量（信號）應與其天然豐度相平行。由于40Ca的天然豐度很大，所以在穩定同位素技術(shù)中極少使用。其余五種都可以用于穩定同位素技術(shù)。在具體選擇使用何種穩定同位素進(jìn)行試驗時(shí)，應從三個(gè)方面來(lái)考慮\[9\]：首先，靜脈給予的穩定同位素劑量不應該影響機體的鈣平衡。44Ca的天然豐度比較大，使用時(shí)的劑量也相對較高（通常10mg以上），因此不用于靜脈注射。其余四種則口服或靜脈注射均可。其次還要考慮質(zhì)譜儀能否檢測穩定同位素及其檢測的準確度，因為一些質(zhì)譜儀是不能準確地檢測46Ca或48Ca的。最后還要考慮同位素的價(jià)格。

1.2 穩定同位素劑量的選擇

    使用穩定同位素技術(shù)時(shí)，有一些因素會(huì )影響所使用同位素的劑量，其中最重要的是總的可交換鈣池的大小（TEP）。TEP包括血漿、細胞外液和代謝活性骨中的鈣，其大小與骨代謝率呈正相關(guān)。由于稀釋效應，所使用的穩定同位素劑量應隨著(zhù)TEP的大小而呈線(xiàn)性增減。例如，對一個(gè)TEP為6g總鈣的個(gè)體來(lái)說(shuō)，要獲得5%的信噪比，需靜脈注射195mg42Ca、04mg 43Ca、624mg 44Ca、00096mg 46Ca或054mg 48Ca，TEP增大一倍，劑量相應增加一倍\[9\]。給予同位素后樣品的收集時(shí)間由于稀釋效應同樣會(huì )影響同位素的劑量。另外一個(gè)影響因素是質(zhì)譜儀的精確度。可檢測穩定同位素的最小量與質(zhì)譜儀的精確度成反比。最小的可檢測信噪比可以按照檢測時(shí)變異系數（CV）的3倍來(lái)估算。例如，測定42Ca\\43Ca值時(shí)的CV是05%，那么樣品中其最小可檢測信噪比最小應該是15%\[9\]。此外，小腸吸收率也是一個(gè)影響因素，吸收率越高，所需的穩定同位素劑量越小，這在做不同年齡或生理狀態(tài)人群的鈣研究時(shí)應予以考慮。

1.3 穩定同位素技術(shù)的分類(lèi)

    穩定同位素技術(shù)根據使用穩定同位素鈣的數量又可分為單穩定同位素技術(shù)、雙穩定同位素技術(shù)和三穩定同位素技術(shù)3種。單穩定同位素技術(shù)是給受試者口服一種同位素鈣，然后收集其糞便直到所有未吸收的口服同位素鈣完全回收為止。然后根據口服的劑量和糞便中回收的量來(lái)計算鈣的吸收率。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是計算出的吸收率不包括內源性分泌鈣，比平衡法更能真實(shí)地反應膳食鈣的吸收，此外這種方法不要求靜脈注射同位素；其缺點(diǎn)是收集糞便時(shí)間較長(cháng)，準確率會(huì )因此而收到影響\[3\]。雙穩定同位素技術(shù)是將待測鈣源用一種穩定同位素鈣標記后,讓受試者以口服方式攝入,然后靜脈注射另一種穩定同位素鈣。口服后吸收入血的同位素鈣與靜脈注射的同位素及機體本身的鈣共同進(jìn)入中央混合鈣池。假定靜脈注射同位素鈣100%吸收且標記的同位素鈣能與食物中普通鈣發(fā)生完全交換,并以相同的比例被吸收和代謝\[10\]，那么一定時(shí)間后,它們在體內將達到完全的代謝平衡。由此,可以根據代謝樣品如尿中的排出量、血中濃度甚至乳汁中濃度來(lái)推算鈣吸收率或進(jìn)行鈣動(dòng)力學(xué)研究\[7\]。   這種方法的優(yōu)點(diǎn)是準確度高，收集樣品的時(shí)間較短。三穩定同位素技術(shù)是讓受試者同時(shí)口服兩種不同的穩定同位素鈣，然后靜脈給予另一種穩定同位素鈣。比如，口服46Ca和48Ca，靜脈給予42Ca。這種方法適用于比較兩種類(lèi)型鈣源的吸收率，但其數據解釋比較復雜，因此較為少用，研究者一般更傾向于使用雙穩定同位素技術(shù)對兩種鈣源吸收率分別進(jìn)行評價(jià)，兩次評價(jià)試驗之間安排一定時(shí)間的洗脫期\[8\]。

1.4 穩定同位素技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

    與放射性同位素技術(shù)相比，穩定同位素技術(shù)不具有放射性，適于孕婦、乳母和兒童的研究，對于成人則可進(jìn)行多次測定；與經(jīng)典的鈣平衡試驗相比，穩定同位素技術(shù)不受腸道排泄不全或者排空時(shí)間變異及尿量等因素的影響，準確度高，收集代謝樣品的時(shí)間較短,既節約了成本也簡(jiǎn)化了操作。其缺點(diǎn)是穩定性同位素的檢測要求有特殊的儀器設備,同位素價(jià)格也較高,只能用于研究工作\[7\]。

2.穩定同位素技術(shù)在鈣營(yíng)養相關(guān)研究中的應用

2.1 測定鈣吸收率

    測定鈣吸收率的方法主要有藥代動(dòng)力學(xué)法、尿增量法、鈣平衡法及同位素法。目前，研究中應用最廣的是雙穩定同位素法\[7\]。Beck的研究表明雙穩定同位素法是測定食物鈣吸收率的可靠方法\[10\]。這種方法可以測定機體內源性分泌糞鈣，故其測定出的吸收率是真鈣吸收率（TFCA）,因而被認為是測定鈣吸收率的最佳選擇，已被國際營(yíng)養專(zhuān)家組確定為測定活體鈣生物利用率的金標準\[11\]。
    健康機體對鈣的吸收會(huì )受到年齡、生理狀態(tài)及遺傳等因素的影響，因此目前對于健康個(gè)體鈣吸收研究的重點(diǎn)也主要圍繞這些方面展開(kāi)的。近年來(lái)，許多研究應用雙穩定同位素法對青春期前兒童、青春期青少年的鈣吸收率進(jìn)行了測定\[4,12~14\]，結果顯示，在生長(cháng)期鈣的吸收率明顯增高，并在11~12歲時(shí)達到最高值\[4\]。對孕婦和乳母鈣吸收的研究顯示\[6,15,16\]，孕期鈣吸收率大約是孕前的兩倍，而哺乳期婦女的鈣吸收率并不增加\[6\]。MoserVeillon等用44Ca口服，42Ca靜脈注射的雙穩定同位素法研究發(fā)現產(chǎn)后哺乳與不哺乳婦女其鈣吸收率無(wú)顯著(zhù)差異，而且通過(guò)乳汁中穩定同位素的量確定的鈣吸收率與通過(guò)血清和尿液中穩定同位素量確定的鈣吸收率一致\[15\]。由于鈣吸收受雌激素的影響\[17\]，因此對老年個(gè)體鈣吸收的研究多集中在圍絕經(jīng)期婦女和絕經(jīng)后婦女中。這一時(shí)期的婦女由于卵巢功能下降，內分泌紊亂及雌激素水平降低，其對鈣的吸收通常都是降低的\[18,19\]。隨著(zhù)分子生物學(xué)的進(jìn)展，近來(lái)將穩定同位素技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結合來(lái)評價(jià)基因對鈣吸收影響的研究增多，特別是維生素D受體（VDR）基因多態(tài)性對鈣吸收的影響，已有研究發(fā)現VDR轉錄起始位置Fok1基因多態(tài)性與鈣吸收顯著(zhù)相關(guān)\[20,21\]。關(guān)于遺傳因素對鈣吸收影響的研究逐漸成為目前穩定同位素技術(shù)應用的一個(gè)新領(lǐng)域。

2.2 確定鈣的需要量

    鈣的需要量由于受種族、膳食習慣和評價(jià)標準等因素的影響，故目前世界上不同國家確定的鈣需要量差別很大\[22\]。1997年，美國醫學(xué)學(xué)會(huì )將鈣需要量定義為：能夠獲得理想的骨鈣儲留量、骨質(zhì)質(zhì)量或以后生活中最小的骨折發(fā)病率所需要的鈣攝入量\[11\]。確定鈣需要量的方法一般有3種：因素加算法、骨質(zhì)測定法和平衡法。因素加算法是基于生長(cháng)期的骨鈣增加、骨量維持、生殖需要和必要的鈣損失（尿鈣排出、皮膚鈣丟失和糞鈣丟失），進(jìn)而確定鈣的需要量\[22\]。這種方法存在的問(wèn)題是其所用的鈣吸收率數據均來(lái)自對白種人的研究\[23\]，不適于其它種族。近期隨著(zhù)骨質(zhì)精確測定技術(shù)，如雙能X線(xiàn)骨密度測定儀的應用，使鈣需要量可以直接使用骨質(zhì)含量或密度以及其改變值為評價(jià)指標。然而由于這種方法研究時(shí)間太長(cháng)（通常兩年以上），同時(shí)鈣攝入量和骨質(zhì)指標之間的相關(guān)性較差，用鈣攝入量與骨質(zhì)變化的回歸方程所計算出來(lái)的鈣需要量的95%可信區間很大，所以骨質(zhì)測定法難以精確確定鈣需要量的范圍\[11\]。另一種是平衡法。經(jīng)典的平衡法是將攝入鈣與排出鈣達到零平衡時(shí)的鈣攝入量確定為鈣需要量。這種方法沒(méi)有考慮機體對鈣的適應性，精確度也不高。此后又提出了改良的平衡法。改良的平衡法是先給予一定時(shí)間、一定劑量鈣的適應期，然后進(jìn)行平衡試驗，最后建立鈣攝入和鈣儲留的關(guān)系模型，從而得到鈣需要量\[22\]。現在所說(shuō)的鈣平衡法一般指后者。
近年來(lái)，隨著(zhù)穩定同位素技術(shù)在鈣吸收和代謝研究中的應用，使測定鈣平衡的精度得到較大幅度的提高；同時(shí)由于該法簡(jiǎn)便省時(shí)，所以可以將穩定同位素技術(shù)和鈣平衡試驗相結合來(lái)確定鈣需要量\[9\]。這種研究是在平衡試驗的基礎上，使用雙穩定同位素技術(shù)來(lái)評價(jià)鈣吸收和鈣儲留情況，然后使用線(xiàn)性及非線(xiàn)性回歸模型\[11,24\]來(lái)描述鈣攝入量和儲留量之間的關(guān)系，從而估計鈣的需要量。這種將穩定同位素技術(shù)與平衡試驗結合的方法不僅準確度高，而且省時(shí)省力，也能夠比較真實(shí)反映機體的鈣平衡。目前，雖然該方法受到同位素價(jià)格太高，檢測方法復雜的限制，但其仍是今后確定鈣需要量的最佳方法。此外有關(guān)專(zhuān)家認為鈣平衡技術(shù)與骨質(zhì)測量技術(shù)同為確定鈣需要量的主要手段\[11\]，因此，將穩定同位素技術(shù)，鈣平衡試驗及骨質(zhì)測量技術(shù)相結合可能會(huì )成為未來(lái)評價(jià)鈣需要量方法的發(fā)展方向。

2.3 鈣代謝動(dòng)力學(xué)研究

    鈣代謝動(dòng)力學(xué)是從速率論的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)，用數學(xué)模型分析和研究鈣在體內吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程及其動(dòng)力學(xué)的規律。穩定同位素技術(shù)不僅可以簡(jiǎn)便準確地測定鈣的吸收率，同時(shí)還可建立鈣代謝動(dòng)力學(xué)模型來(lái)進(jìn)一步闡明鈣被機體吸收后的分布和利用情況\[9\]。應用穩定同位素技術(shù)進(jìn)行鈣代謝動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，要求在受試者口服和靜脈給予穩定同位素后，收集其在6，12，20，30，45，60，120，180，240，480min的血清樣（05ml）和5~6d現場(chǎng)尿樣（不少于2次/天）。然后測定樣品中穩定同位素的豐度。最后用房室模型對鈣動(dòng)力學(xué)過(guò)程作出解釋\[3\]。Wastney等進(jìn)行的試驗\[13\]就是一個(gè)典型的應用穩定同位素鈣（42Ca和44Ca）進(jìn)行鈣代謝動(dòng)力學(xué)的研究。近年來(lái)，應用穩定同位素法進(jìn)行的鈣動(dòng)力學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現骨鈣的沉積率和清除率與可交換的骨鈣池大小密切相關(guān)\[4\],當機體攝入鈣在一定范圍內增加時(shí)，機體對鈣的儲留量也增加\[14\]。一項研究還比較了不同種族女童的鈣代謝動(dòng)力學(xué)差異\[12\]。另有研究表明患有囊性纖維變性的青春期女孩的骨鈣沉積率低于同齡健康女孩\[25\]。目前，鈣缺乏問(wèn)題在世界各國均十分普遍，迫切需要制定科學(xué)的鈣需要量，而確定科學(xué)的鈣需要量要求有大量準確的鈣代謝動(dòng)力學(xué)數據。因此可以預計，穩定同位素技術(shù)在這一領(lǐng)域的應用將會(huì )越來(lái)越多。

2.4 評價(jià)影響鈣吸收和代謝的因素

    機體對鈣的吸收和代謝受到多種因素的影響，科學(xué)地評價(jià)這些因素的作用對于合理膳食，科學(xué)補鈣及預防疾病有著(zhù)重要意義。由于穩定同位素技術(shù)在測定鈣吸收和代謝方面的廣泛應用，所以目前研究影響鈣吸收和代謝因素的試驗中，穩定同位素技術(shù)的使用也較為普遍\[17,18\]。近年來(lái)，使用穩定同位素技術(shù)研究影響鈣吸收和代謝最多的是膳食因素，如蛋白質(zhì)對鈣吸收的影響\[26\]，低聚糖對絕經(jīng)后婦女鈣吸收的影響\[19\]。此外還有一些試驗研究體力活動(dòng)和疾病對鈣吸收和代謝的影響\[18,25\]。另外有報道稱(chēng)使用多種元素的穩定同位素可以用來(lái)直接評價(jià)補充多種元素后這些元素的生物利用情況及相互作用\[3\]。
    綜上所述，隨著(zhù)穩定同位素技術(shù)的日益成熟，在人類(lèi)鈣吸收和代謝研究中，已經(jīng)由使用放射性同位素逐步轉向使用穩定同位素，不過(guò)，目前其在鈣營(yíng)養相關(guān)研究中的應用仍是一個(gè)相對較新的領(lǐng)域。此外，由于目前在鈣生物利用的相關(guān)基因確定方面取得了較大進(jìn)展，這可能會(huì )為穩定同位素技術(shù)開(kāi)辟一個(gè)新的重要的應用領(lǐng)域。我國在使用穩定同位素技術(shù)進(jìn)行鈣營(yíng)養研究方面才剛剛起步，這類(lèi)研究也較少，目前僅在香港和北京等少數地區開(kāi)展。但是，隨著(zhù)我國社會(huì )逐漸向老齡化發(fā)展，準確確定國人鈣吸收和代謝的相關(guān)數據，進(jìn)而制定出適合各個(gè)人群的鈣膳食推薦攝入量（DRIs）是提高國民健康水平的迫切任務(wù)，因此可以預計穩定同位素技術(shù)在我國的應用前景是非常廣闊的。不過(guò)可以肯定的是這種方法相對昂貴的價(jià)格和復雜的檢測技術(shù)將會(huì )成為近幾年其在鈣營(yíng)養相關(guān)研究領(lǐng)域發(fā)展的主要制約因素，其廣泛的應用到研究中還有待時(shí)日。

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