劉敏捷1 師邱毅1 賈玉珠2 趙瑛2 郝麗榮2
1.內蒙古自治區衛生防疫站
2.包頭市衛生防疫站
（呼和浩特市錫林南路136號 郵編：010020）

　　抗生素在畜禽等生物防病中起著(zhù)重要作用，但如果過(guò)量或使用不當會(huì )產(chǎn)生一些毒副作用，甚至危害到人體健康。牛乳是我國廣大嬰幼兒、孕婦、病人及健康人群的常用食品，因其營(yíng)養價(jià)值高，營(yíng)養成分齊全，并且容易消化吸收，在預防和緩解疾病中有著(zhù)極為重要的作用。但目前我國對牛乳中的抗生素殘留還未制定標準，亦沒(méi)有標準檢驗方法。為了能夠準確測定出牛乳中的四環(huán)素、土霉素的含量，我們摸索了以鹽酸為介質(zhì)，采用高壓液相色譜同時(shí)測定牛乳中四環(huán)素、土霉素的方法，獲得滿(mǎn)意結果，本方法的最低檢出限分別為：四環(huán)素0.1ug/mL，土霉素0.07 ug/mL。

關(guān)鍵詞：牛乳、土霉素、四環(huán)素。
1.實(shí)驗原理：
　　樣品經(jīng)鹽酸介質(zhì)提取，經(jīng)0.45um微孔濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣，用反相色譜柱分離，紫外檢測器檢測，與標準系列比較峰高定量，出峰順序為土霉素、四環(huán)素。

2.試劑：
2.1.土霉素（OTC）標準溶液：稱(chēng)取土霉素標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，0487-200001，含量92.4%）0.0108g，用0.1moL/L鹽酸溶解并定容至10.0 mL，相當于每毫升含土霉素1.000mg。

2.2.四環(huán)素（TC）標準溶液：稱(chēng)取四環(huán)素標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，0488-200001，含量98.7%）0.0101g，用0.1moL/L鹽酸溶解并定容至10.0 mL，相當于每毫升含四環(huán)素1.000mg。

2.3.混合標準溶液：取上述兩種標液各1.0 mL，用10%HCl定容至10.0 mL。此溶液每毫升相當于含土霉素、四環(huán)素各0.100 mg，臨用時(shí)現配。

2.4.乙腈（色譜純）：河北廊坊市興科化工有限公司。

2.5.0.01 moL/L磷酸二氫納溶液：稱(chēng)取15.6g磷酸二氫納（NaH2PO4·2H2O）溶于蒸餾水中，定容到1000 mL。經(jīng)0.45 um濾膜，用30%（V/V）硝酸調PH為2.5-2.8備用。

3.儀器：

3.1.日本島津產(chǎn)LC-10AVP高效液相色譜儀，配CLASS-VP工作站，具有紫外檢測器。

3.2.CX-100型超聲波清洗機，北京市醫療設備二廠(chǎng)生產(chǎn)。

4.色譜條件；
　　色譜柱：YWC-C18 10 um不銹鋼柱4.6mm (id)×250 mm；檢測波長(cháng)：355nm；柱溫：35℃；流速；1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10uL；流動(dòng)相：A泵-0.01 moL/L磷酸二氫納溶液（PH為2.5-2.8），0.65 mL/min；B泵-乙腈，0.35 mL/min。兩流動(dòng)相在使用前超聲脫氣10 min以上。

5.樣品預處理：

　　取2.5 mL牛乳，加2.5 mL10%（V/V）鹽酸振搖2 min，移入離心管中，以3000轉/ min離心3 min。取上清液經(jīng)0.45 um針式濾膜過(guò)濾，濾液備用。

6.標準工作曲線(xiàn)的制作：

圖1

圖1為T(mén)C標準曲線(xiàn)，濃度為5 ug/ mL、10 ug/ mL、15 ug/ mL。

圖2

圖2為T(mén)C標準曲線(xiàn)，濃度為20 ug/ mL、30 ug/ mL、50 ug/ mL。

圖3

圖3為OTC標準曲線(xiàn)，濃度為5 ug/ mL、10 ug/ mL、15 ug/ mL。

圖4

圖4為OTC標準曲線(xiàn)，濃度為20 ug/ mL、30 ug/ mL、50 ug/ mL。

7.討論：

7.1.流動(dòng)相的選擇：

用乙腈和0.01 moL/L磷酸二氫納溶液的多種比例進(jìn)行試驗，發(fā)現乙腈濃度為35%時(shí)為最佳比例。一般情況下乙腈的比例控制在32%-40%之間。

7.2.柱溫的選擇：

柱溫的高低對分離速度和柱壓都有影響。本實(shí)驗我們選定柱溫為35℃（高于室溫10℃左右），以利于保留時(shí)間和峰高的穩定，使分離不受溫度波動(dòng)的影響，并降低柱壓。

7.3.PH的選擇：

本實(shí)驗中，PH值對測定結果影響很大，如果PH值太低即小于2.0時(shí)，會(huì )損害色譜柱，如果PH值偏高即大于3.0時(shí)，兩峰無(wú)法分離。所以，本實(shí)驗的PH值控制在2.5-2.8之間。

7.4.精密度試驗：

在同一份牛乳中加入土霉素和四環(huán)素標準質(zhì)其含量為10 ug/mL。兩天測定六次（樣品處理后很容易分解，放置時(shí)間不宜超過(guò)兩天），結果見(jiàn)表1

表1 精密度試驗

7.5.回收率實(shí)驗：

以牛乳作本底樣品，添加三種濃度標準液，使定容后的液體含標準濃度分別為2.5ug/mL、10.0ug/mL、30.0 ug/mL，測得的回收率見(jiàn)表2。由表2可以看出，土霉素回收率在78.0-98.0%之間，四環(huán)素在84.0-95.7%之間。

表2 回收率實(shí)驗

7.6.方法檢出限：

按3倍噪音計算，土霉素、四環(huán)素的最低檢出濃度分別為0.07 ug /mL，0.10 ug /mL。

7.7.主要干擾因素：

通過(guò)實(shí)驗我們發(fā)現下列問(wèn)題會(huì )直接影響到測定結果。

⑴ 由于土霉素和四環(huán)素分解很快，特別是低濃度時(shí)，所以混合標準品必須臨用現配，單標液冷凍不超過(guò)1周，這樣就要求樣品處理后應立即進(jìn)樣測定；

⑵ 目前國家標準GB/T14931.1-1994選用高氯酸作為提取劑來(lái)測定畜禽中抗生素的殘留。實(shí)驗中我們發(fā)現，高氯酸氧化性極強，對被測成份及分離柱均有嚴重損害，因而嚴重影響測定結果。本實(shí)驗選用5%鹽酸作為提取劑，測定結果令人滿(mǎn)意；

⑶ 流動(dòng)相和緩沖液的PH值對實(shí)驗結果影響很大，流速太快或太慢都會(huì )影響兩峰的分離，因此在實(shí)驗過(guò)程中要嚴格控制流動(dòng)相的流速和緩沖液的PH值；

⑷ 實(shí)驗中發(fā)現兩峰的保留時(shí)間比較近，分離度較差，所以計算時(shí)用峰高定量。

參考文獻：[1]藤田和弘等 食品衛生學(xué)雜志 1997.38（1）

[2]GB/T14931.1-1994畜禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量測定方法（高效液相色譜法）

作者簡(jiǎn)介：劉敏捷，女，內蒙古自治區衛生防疫站副站長(cháng)，主任醫師，從事食品衛生、食品毒理專(zhuān)業(yè)二十余年，先后完成國家級、省部級科研課題多項，并在國家級雜志發(fā)表論文二十余篇。現為中國公共衛生雜志編委和內蒙古自治區預防醫學(xué)會(huì )理事。