高鍵 薛安娜
復旦大學(xué)醫學(xué)院附屬中山醫院營(yíng)養科，上海 200032

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸　ECV304細胞　細胞凋亡

　　中圖分類(lèi)號：R151.2 TS201.2 文獻標識碼:A
Study on the apoptosis induced by homocysteine
Gao Jian,Xue Anna
Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032, China
　　Abstract: Objectives:This study focused on the homocysteine－induced apoptosis of the ECV304 cell line, a spontaneously transformed immortal human endothelial cell line. Methods: The cytotoxicity of Hcy on the ECV304 cell line was measured by MTT assay. The apoptosis induced by Hcy was observed by morphologic methods, such as H.E. staining, Acridine Orange fluorescence staining, and transmission electron microscopy (TEM). DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry were used in combination to confirm the apoptosis. Results: The results show that Hcy(1～10mmol/L) produced dose－dependent and time－dependent suppression of ECV304 growth. Morphological evidences indicate that the ECV304 cell line revealed characteristic changes of apoptosis after treatment with 5.00mmol/L Hcy for 48 hours. With DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry, characteristics of apoptosis were evident after treatment with 5.00mmol/L Hcy for 36 hours. Conclusions: Hcy can inhibit the growth of ECV304 and induce the ECV304 cell line apoptosis.
Key words: homocysteine,ECV304,apoptosis

1 中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所

　　同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，高同型半胱氨酸(Hcy)血癥是致動(dòng)脈粥樣硬化的獨立危險因子。葉酸及VB6、VB12等營(yíng)養素通過(guò)參與蛋氨酸和半胱氨酸代謝調節血中同型半胱氨酸的濃度。由于各種因素導致的血中Hcy濃度升高被認為是獨立于其它已知的危險因素(高血壓、高膽固醇血癥、吸煙、肥胖等)的致動(dòng)脈粥樣硬化的危險因子[1,2]。近年來(lái)的研究發(fā)現，Hcy可損傷血管內皮細胞[3]，促進(jìn)血管平滑肌細胞的增殖[4]，改變血液系統的抗凝狀態(tài)及血小板功能[5]，促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化等[6]。 Hcy實(shí)際上參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的各個(gè)階段。本研究旨在探討Hcy通過(guò)誘導細胞凋亡而損傷血管內皮細胞的機制。

1　材料與方法

1.1　細胞培養

　　人臍帶靜脈內皮細胞株（ECV304細胞），由正常人臍帶靜脈內皮細胞自發(fā)轉化而成，呈典型的單層鑲嵌排列，有接觸抑制，可無(wú)限傳代，不需要另加特殊的細胞生長(cháng)因子。血管內皮細胞特有的Weibel－Palade 小體檢測陽(yáng)性，病毒顆粒檢測陰性。ECV304細胞生長(cháng)于完全M199培養基（含10％胎牛血清，20mmol/L Hepes、100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素），培養條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。細胞傳代時(shí)以0.25％的胰酶消化，稀釋成1×105/ml的細胞懸液接種。

1.2　試劑與儀器

　　同型半胱氨酸、碘化丙啶(PI) 、MTT和Hepes為Sigma公司產(chǎn)品；M199培養基為GIBCOBRL公司產(chǎn)品；胰酶為Hyclong公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為Promag公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)質(zhì)純。超凈工作臺，CO2孵箱（美國VWR Scientific Inc, 1720型），516MC型自動(dòng)酶標儀，流式細胞儀（美國Canlter公司EPICS型），透射電子顯微鏡（日本JEOL公司JEM－1010型），激光共聚焦掃描電子顯微鏡（美國Meridian公司Ultima212型）。

1.3　方法

1.3.1　MTT法測定Hcy對ECV304細胞增殖的抑制作用　取對數生長(cháng)期細胞消化成單細胞懸液，調節細胞濃度為1×104/ml，接種于96孔細胞培養板，每孔接種100μl，分為9個(gè)劑量組，每組8個(gè)平行孔。接種24h后，細胞貼壁生長(cháng)，棄上清，此時(shí)加入含不同濃度的Hcy完全M199培養基每孔100μl，繼續培養12、24、48h后每孔加MTT 20μl（5mg/ml）。繼續培養4h，棄上清，加DMSO 200μl/孔，震蕩搖勻，自動(dòng)酶標儀于490nm測各孔吸光度。考察Hcy對ECV304細胞增殖的抑制作用時(shí)，以其抑制率（IR）表示。

對照組A值－給藥組A值

細胞抑制率IR（％）=×100％

　　 對照組A值

1.3.2　蘇木精—伊紅（HE）染色　將蓋玻片置于平皿中，傳入細胞，使細胞達到1×104/ml，接種24h后細胞在蓋玻片上貼壁生長(cháng)，棄上清，換含5mmol/L Hcy的完全M199培養基，繼續培養48h后取出蓋玻片進(jìn)行染色觀(guān)察。

1.3.3　吖啶橙熒光染色法　調節細胞濃度為1×105/ml，接種于25ml細胞培養瓶。接種24h后，細胞貼壁生長(cháng)，棄上清，加入含5mmol/L Hcy的完全M199培養基，繼續培養48小時(shí)后取出消化成單細胞懸液,調節細胞濃度為5×106/ml。取95μl的細胞懸液，加5μl的吖啶橙染液混勻。置室溫5～10min。吸一滴混合液點(diǎn)于潔凈的載玻片上，直接用蓋玻片封片。在激光共聚焦掃描電子顯微鏡下觀(guān)察并攝片。

1.3.4　電鏡觀(guān)察　調節細胞濃度為1×105/ml，接種于100ml細胞培養瓶。接種24h后，細胞貼壁生長(cháng)，棄上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培養基，繼續培養48小時(shí)后取出制作電鏡樣品。用自制細胞刮子將細胞刮下，收集于1.5ml的離心管。5％的戊二醛固定，1％鋨酸固定，50％～100％乙醇，100％丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹(shù)脂Epon821浸透12h，60℃24h聚合。常規超薄切片，經(jīng)50％乙醇飽和，醋酸雙氧鈾－枸櫞酸鉛雙重染色。在透射電鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)、細胞膜、細胞器及細胞核的變化。

1.3.5　瓊脂糖凝膠DNA電泳　調節細胞濃度為1×105/ml，接種于100ml細胞培養瓶。接種24h后，細胞貼壁生長(cháng)，棄上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培養基，繼續培養12、24、36、48h后取出提取DNA。采用Promag公司的DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作。DNA 電泳： 1.5％瓊脂糖鋪板，加入EB(終濃度為0.5μg/ml)。取樣品20μl（DNA約為100～300ng/孔）加入6×上樣緩沖液，混勻，為上樣液。Marker采用Biolab公司100bp DNA Ladder。電壓15V/cm（50V，50mA）電泳4h，紫外燈下觀(guān)察并拍照。

1.3.6　流式細胞儀測定　調節細胞濃度為1×105/ml，接種于100ml細胞培養瓶。接種24h后，細胞貼壁生長(cháng)，棄上清，加入5mmol/L Hcy的完全M199培養基，繼續培養12、24、36h后進(jìn)行PI染色并測定。消化成單細胞懸液，離心，棄上清， PBS洗細胞一次，用300目篩網(wǎng)過(guò)濾2次。預冷70％乙醇固定，4℃保存。染色前離心，棄固定液，PBS洗細胞。加入200μl Rnase A，37℃水浴30min。加入800μml PI染液，混勻，至4℃避光30min。記錄激發(fā)波長(cháng)488nm處紅色熒光。

2　結果

2.1 MTT法測定Hcy對ECV304細胞增殖的抑制作用

　　如附表所示，1～10 mmol/L劑量的Hcy對ECV304細胞的生長(cháng)有抑制作用，且隨劑量的增加，作用時(shí)間的延長(cháng)，抑制作用亦增強。 2.2　蘇木精—伊紅（HE）染色

　　光學(xué)顯微鏡下正常細胞為多角形，單層鑲嵌排列，細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紫色（如圖1）。凋亡細胞（5mmol/L Hcy作用48h）單個(gè)散在分布，表現為核染色質(zhì)致密濃縮，核固縮（如圖2）。

2.3　吖啶橙熒光染色法

　　在激光共聚焦掃描電子顯微鏡下觀(guān)察，正常細胞為圓形或橢圓形，細胞結構完整，細胞核為均勻綠色熒光（如圖3）。凋亡細胞可見(jiàn)細胞核固縮，染色質(zhì)周邊化，在核膜內側形成新月體，或核碎裂成片段，分布在核膜周邊。還可見(jiàn)到出芽形成的凋亡小體（如圖4）。

2.4　電鏡觀(guān)察

　　與正常細胞相比，在5mmol/L的Hcy作用48h后，可見(jiàn)較多凋亡細胞，其形態(tài)特征是細胞體積變小，細胞質(zhì)密度增高，線(xiàn)粒體及內質(zhì)網(wǎng)結構不清晰，核變小，染色質(zhì)濃縮并聚集成塊（如圖5～圖6）。

2.5　瓊脂糖凝膠DNA電泳

　　實(shí)驗中可見(jiàn)正常細胞DNA條帶停留在加樣孔附近，5mmol/L Hcy作用12、24和48h時(shí)形成一條彌散條帶，36h時(shí)可見(jiàn)明顯的“DNA階梯” （如圖7）。

2.6　流式細胞儀測定

　　在5mmol/L Hcy作用12～36h后，在DNA熒光直方圖上，凋亡細胞出現二倍體峰（G1細胞）的減少，在G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰形，而且隨著(zhù)Hcy作用時(shí)間的延長(cháng)，亞二倍體峰逐漸變大。隨著(zhù)Hcy作用時(shí)間的延長(cháng)，凋亡指數由0.7％上升到了17.7％。

3　討論

　　Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，它將含硫氨基酸、還原性葉酸及VB6、VB12等聯(lián)系起來(lái)，其代謝處于再甲基化作用和轉硫化作用兩個(gè)代謝的交叉點(diǎn)。遺傳因素、營(yíng)養缺乏等原因可導致血中Hcy升高，造成高同型半胱氨酸血癥。近年來(lái)的研究表明，同型半胱氨酸是一種具有細胞毒性和神經(jīng)毒性的因子[7]。

　　實(shí)驗結果提示，Hcy對ECV304細胞的增殖有明顯的抑制作用。隨劑量的增加，作用時(shí)間的延長(cháng)，抑制作用亦增強，存在著(zhù)劑量－反應關(guān)系。 　　光學(xué)顯微鏡觀(guān)察（HE染色）、熒光顯微鏡觀(guān)察（吖啶橙熒光染色）以及電鏡觀(guān)察細胞超微結構的結果都發(fā)現，5mmol/L的Hcy在作用48h后出現了典型的細胞凋亡特征。在瓊脂糖凝膠DNA電泳中，5mmol/L的Hcy在作用36h后出現了典型的“DNA Ladder",即DNA被核酸內切酶降解為180～200bp整倍數的寡核小體片段，而在12、24、48h均為彌散的條帶。在細胞凋亡特征性的“DNA Ladder"出現后12h才出現明顯的細胞形態(tài)學(xué)改變，這表明DNA斷裂的出現要早于形態(tài)學(xué)方面的變化。細胞凋亡的另一個(gè)特征性的表現是在流式細胞儀檢測中，在DNA熒光直方圖上可呈現明顯的亞二倍體核型峰的特征。研究中發(fā)現凋亡細胞出現亞二倍體峰與DNA電泳出現“DNA Ladder"具有同步性，均在5mmol/L的Hcy作用36h后出現。綜合細胞形態(tài)學(xué)與DNA電泳及流式細胞儀檢測的結果，可以確認5mmol/L Hcy可以誘導ECV304細胞的異常凋亡，這可能是高同型半胱氨酸血癥造成血管內皮細胞損害的重要機制之一。

4　參考文獻

1　Graham IM ,Daly LE ,Refsum HM ,et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease. JAMA ,1997,277:759－781

2　Hankey GJ, Eikelboom JW. Homocysteine and vascular disease. Lancet, 1999 ,354:407－413

3　Doshi Sn, Goodfellow J, Lewis MJ, et al. Homocysteine and endothial function. Cardiovascular Res, 1999, 42:578－582

4　田學(xué)軍，周愛(ài)儒，湯健，等. 同型半胱氨酸對大鼠血管平滑肌增殖的作用.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，1998,14（1）：108－112

5　Nishinaga M, Ozawa T, Shimada K. Homocystein,a thromdogenic agent, suppresses anticoagulant heparan sulfate expression in cultured poricine aortic endothelial cell. J Clin Invest, 1993,92:1381－1386

6　Andrew O,Sudesh K,Sood MJ, et al. Homocysteine－induced endoplasmic reticulum stress and growth arrest leads to specific changes in gene express in human vascular endothlial cells. Blood, 1999, 94(3):959－967

7 高煒. 全國高同型半胱氨酸血癥與疾病學(xué)術(shù)研討會(huì )紀要.中華醫學(xué)雜志，1999，79(6):406－410