李勇
北京大學(xué)公共衛生學(xué)院，北京 100083

　　關(guān)鍵詞：5，10—亞甲基四氫葉酸還原酶　先天性心臟病　病例－對照

　　中圖分類(lèi)號：R151．2　R591　 文獻標識碼：A
Effect of parental MTHFR genetype on offspring
congenital heart disease risk
Li Yong
Dept. of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University,Beijing 100083, China
　　Abstract：Objective　The aim of this study is to clarify the association between parental MTHFR genetype and fetal phentype of congenital heart disease(CHD). Methods　It was designed as a group matched case－control study. Venous blood were collected from case group including 174 pairs of parents and control group comprised of 97 mother－father pairs.Genetype(C677T) of each sample was determined by PCR－RFLP. Results　When the MTHFR C677T genetype or the allele(T) frequency of father and mother are compared separately, no statistical significance is found.However the total allel(T) frequency is significantly higher in the cases(58.76％) than in the controls(50.77％)while we put parents together .The value of OR is 1.30(95％CI,1.01,1.68;P=0.037).There is no difference each two combinations of the six possible father－mother genetype combinations. The father TT－mother TT combination had a relative risk of 3.83 for the other parents' genetype conbination noteworthily. Higher probabilities of the offspring being homozygotes(TT),higher the risk for CHD occurrence had been discovered. Conclusions　The genetype of MTHFR of father has the same impact on his CHD child as the one of mother. Parental genotypes TT might increase the occurrence of congenital heart disease in offsping.Children carrying MTHFR homozygotes (TT) have higher risk for CHD.
　　Key words：methylenetetrahytdrofolate reductase, congenital heart disease, case－control study　　

　　先天性心臟病（簡(jiǎn)稱(chēng)先心病，congenital heart disease，CHD）是嬰幼兒心臟疾患中最常見(jiàn)的疾病。它是指出生時(shí)就存在的心血管結構或功能異常，是由于胎兒時(shí)期心血管發(fā)育異常或發(fā)育障礙以及出生后應退化的組織未能退化造成的心血管畸形。除少數先心病是由單基因突變和染色體畸變引起外，大多數先心病是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用引起的多基因遺傳病。

　　同型半胱氨酸代謝酶(homocystein,Hcy)是甲硫氨酸代謝中產(chǎn)生的一種含硫醇的氨基酸，其代謝處于再甲基化作用和轉硫化作用這兩個(gè)代謝途徑的交叉點(diǎn)。參與HCY代謝的關(guān)鍵酶之一，5，10－亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10－methylenetetrahydro－folate reductase ,MTHFR)， 催化5，10－亞甲基四氫葉酸還原為5－甲基四氫葉酸，后者是體內主要的甲基供體，參與核酸合成的一碳單位轉移。5,10－亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)對決定Hcy水平有重要的作用,該酶的缺陷可導致5－甲基四氫葉酸合成減少,使Hcy不能甲基化為蛋氨酸而造成堆積。MTHFR由MTHFR基因編碼,該基因677C→T突變可以使Hcy升高達3倍以上,導致中、高度的Hcy血癥[1]。本研究旨在探討父母雙方MTHFR基因型與后代發(fā)生先天性心臟病風(fēng)險之間的關(guān)系。

1　研究方法

1.1　樣本量確定

　　用Epi 2000計算樣本量，α=0.05,1－β=0.8，選取北方人群暴露率為30％，OR=2，按1：2（對照：病例）成組匹配病例－對照研究設計，需要病例組父母185對，對照組父母92對。本次研究得到病例組父母174對，對照組97對，基本滿(mǎn)足設計要求。

1.2　研究對象

　　CHD父母年齡為25～35歲，均來(lái)自遼寧省的各個(gè)市縣，包括撫順、沈陽(yáng)、蓋洲市、阜新縣、燈塔市、莊河市、大連金洲、大連開(kāi)發(fā)區、大連市、瓦房店市等地。對照是與病例同一地區的生育健康孩子的健康成人。

1.3　資料收集

　　在護士采集外周血液的同時(shí)，由負責醫生填寫(xiě)登記表，登記表包括父母、孩子的姓名、年齡、民族等一般情況及病例組母親的異常孕產(chǎn)育史、孕期患病、服藥、接觸射線(xiàn)、農藥等可導致孩子患先心病的因素。

1.4　基因型檢測

　　用鹽析法提取血液中的DNA,PCR－RFLP方法檢測基因型。PCR反應所用的引物為5' －TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA－3'（sense）， 5'－AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG－3'(antisense)。PCR反應條件參考文獻[2]。將PCR產(chǎn)物用限制性?xún)惹忻窰inf I于37℃消化過(guò)夜后,在12％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.5　統計分析

　　用SPSS For Windows 11.0統計軟件和Epi Infor2000軟件進(jìn)行統計分析，分析內容為：（1）分別比較父親和母親的MTHFR第677位基因型、C和T等位基因頻率，計算OR值和95％可信區間，進(jìn)行Mantel－Haenszel，χ2檢驗；（2）比較兩組父母組合MTHFR基因677位C和T等位基因頻率是否有差異；（3）計算兩組父母可能生育純合突變胎兒概率的比值。

2　結果

2.1　病例組和對照組父母基因型構成比的比較

　　分別比較病例、對照組父親及母親基因型構成比是否有顯著(zhù)性差異，如表1所示兩組父母的基因型構成比在統計學(xué)上無(wú)顯著(zhù)差別。

2.2　兩組父母MTHFR基因677位C和T等位基因頻率比較

　　如表3、4所示，兩組父母親的等位基因頻率在統計學(xué)上無(wú)顯著(zhù)差別。

2.3　病例組與對照組父母組合的等位基因頻率比較

　　如表5所示，兩組等位基因頻率有差別，說(shuō)明父母二人所含有的T等位基因數目越多，后代患先心病的可能性越大。

2.4　病例組與對照組父母基因型組合的比較

　　對兩組中父母基因型的各種組合（TT/TT，TT/CT，TT/CC，CT/CT，CT/CC，CC/CC）構成比進(jìn)行比較（見(jiàn)表6）。總的說(shuō)來(lái)，父母的各種基因型組合在病例與對照組中沒(méi)有顯著(zhù)性差異，但父母雙方均是純合突變的樣本數量要高于對照組，將父母雙方均是純合突變的組合的構成比進(jìn)行χ2檢驗，結果有統計學(xué)差別（χ2=5.10，P=0.024），OR為3.84（1.04～16.79）。

2．5　病例組與對照組中后代發(fā)生純合突變的概率

　　病例組與對照組的親代將兩個(gè)突變等位基因TT都傳遞給后代的差異的比較（見(jiàn)表7）。

　　對照組后代純合突變總概率:

　　P1=(37×0＋27×0.25＋30×0.5＋3×1)/（37＋27＋30＋3）= 0.255

　　病例組后代純合突變總概率:

　　P2=(47×0＋51×0.25＋57×0.5＋19×1)/（47＋51＋57＋19）=0.340

　　二者比值：P2/P1=1.33，說(shuō)明后代是純合突變的概率越大，患先心病的風(fēng)險性也就越大。進(jìn)行兩樣本率的比較，P=0.00014,有統計學(xué)差異。

3　討論

　　從1995年首先闡述神經(jīng)管畸形與MTHFR C677T純合突變有關(guān)開(kāi)始[3,4]，相繼有多項研究表明MTHFR677TT基因型是神經(jīng)管畸形、冠心病、高血壓等疾病的一個(gè)危險因子，但MTHFR677TT與先心病之間的關(guān)系的研究卻鮮有報道。動(dòng)物實(shí)驗顯示同型半胱氨酸可誘導雞胚先天性心臟畸形發(fā)生[5]。影響先心病發(fā)生的因素包括環(huán)境和遺傳，前者既有母親在懷孕期間所處的外環(huán)境還有胎兒所處的母親本身提供的發(fā)育環(huán)境。如果母親是MTHFR677TT基因型，可能導致體內同型半胱氨酸水平升高，進(jìn)一步影響胎兒心臟正常發(fā)育。遺傳因素，孩子所得到的遺傳信息一半來(lái)自父親，一半來(lái)自母親，而且越來(lái)越多的研究資料表明來(lái)自父母雙方的同源染色體或等位基因存在著(zhù)功能上的差異（即遺傳印記）[6]，在此意義上講，父親與母親的作用同等重要。本研究的目的就是探討父母MTHFRC677T基因型對后代患先心病的影響。

　　本研究對父親和母親的基因型構成及MTHFR基因677位C和T等位基因頻率進(jìn)行單獨比較，結果顯示沒(méi)有統計學(xué)差異；將父母雙方合在一起，比較兩組等位基因頻率，發(fā)現病例組父母總的T等位基因頻率(58.76％)顯著(zhù)高于對照組(50.77％)，提示先心病胎兒從父母遺傳得到的T等位基因數目可能要高于正常胎兒；此研究還將父母的各種基因型組合，兩兩比較其在兩組中比例，也未見(jiàn)有統計學(xué)差異，但病例組父母均為純合突變的比例顯著(zhù)高于對照組（P<0.05），提示與父母雙方為其他種組合方式相比，如果父母都是純合突變，孩子患先心病的幾率要大一些。

　　本次研究還計算了兩組后代繼承親代等位基因T發(fā)生純合突變的可能性。MTHFR是常染色體遺傳，父母雙方只要有一個(gè)為正常型，后代一定不會(huì )是純合突變型TT；父母雙方均為雜合子，后代有0.25的可能是純合子；父母一方為純合子一方為雜合子，后代則有0.5的可能是純合子，當父母均為純合子時(shí)，后代一定是純合子。據此計算得病例組后代中發(fā)生純合突變的總概率為0.340，對照組為0.255， P<0.05，有統計學(xué)差異差別（P<0.05）。提示孩子MTHFR677TT基因型與先心病發(fā)生有關(guān)。此結果與Junker等人進(jìn)行的病例一對照研究相符。Junker等人對114名CHD病人228名健康對照的MTHFR的677位點(diǎn)的基因型與先心病之間的關(guān)系作了研究，認為MTHFR677TT基因型與先天性心臟結構畸形的發(fā)生顯著(zhù)相關(guān) [7]。

　　由于未見(jiàn)父母MTHFR677TT基因型與先心病關(guān)系的報道，此次研究結果還無(wú)法與國內外相關(guān)的研究進(jìn)行比較。此次研究存在幾點(diǎn)不足：（1）病例組父母是調查期間存活的先心病患兒雙親，不包括那些由于先心導致流產(chǎn)、死胎、出生后死亡的患兒父母，同時(shí)病例組樣本來(lái)自醫院、婦幼保健院等醫療機構，存在選擇偏倚；（2）由于要根據知情同意原則采集樣本，對照是健康孩子的父母，有可能不合作，導致對照組樣本數偏少；（3）按心臟畸形的類(lèi)型或父母基因型組合進(jìn)行分層，每一層的樣本數量不足。

4　參考文獻

1　Thomas G,Deloughery,Adam Evans BS,et al.Common mutation in methylene－ tetrahydrofolate reductase correlation with homocysteine in metabolism an late－onset vascular disease. Circulation, 1996,94: 347－354

2　Frosst P,Blom HJ,Milos R,et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylene－ tetrahydrofolate reductase. Nat Genetic, 1995,10:111－113

3　Whitehead AS,Gallagher PM,Mills JL, et al.A genetic defect in 5,10 methylene －tetrahydrofolate reductase in neural tube defects.Q J Med,1995,88:763－766

4　Van der Put NM,Steegers－Theuissen RP,Frosst P,et al. Mutated methylene－ tetrahydrofolate reductase as a risk factor for spina bifida. Lancet,1995,346: 1070－ 1071 　

5　李勇，李松，陳光慧,等. HCY－2 基因和同型半胱氨酸與雞胚先天性心臟畸形發(fā)生的關(guān)系.中華醫學(xué)雜志，2000，2(80):131－134

6　李璞.醫學(xué)遺傳學(xué). 北京：中國協(xié)和醫科大學(xué)出版社，1999，36－38

7 Junker R,Kotthoff S, Vielhaber H. Infant methylenetetrahydrofolate reductase 667TT genotype is a risk factor for congenital heart disease .Cardiovasc Res，2001,(51)：2510－2514

表1 病例組與對照組父親基因型構成比較(1) 組 別 CC n 占(%) CT n 占(%) TT n 占(%) 合計 N 占(%)

對照組 21 21.6 54 55.7 22 22.7 97 100

病例組 25 14.4 99 56.9 50 28.7 174 100 注：（1）χ2=2.82, P=0.244

表2 病例組與對照組母親基因型構成比較（1） 組 別 CC n 占 (%) CT n 占 (%) TT n 占 (%) 合計 N 占(%)

對照組 20 20.6 55 56.7 22 22.7 97 100病例組 29 16.7 90 51.7 55 31.6 174 100

注：（1）χ2=4.90,P=0.086

表3 兩組父親MTHFR基因677位Ｃ和Ｔ等位基因頻率比 較(1)

組別 C等位基因n T等位基因n 合計N(%)

對照組 96 98 194（100）

病例組 149 199 348（100）

注：（1）OR=1.31(0.91,1.89)；χ2=2.23,P=0.135 

表4 兩組母親MTHFR基因677位Ｃ和Ｔ等位基因頻率比 較（1）

組別 C等位基因n T等位基因n 合計N(%)

對照組 95 99 194（100）

病例組 148 200 348（100）

注：（1）OR=1.30(0.90,1.87)；χ2=2.09,P=0.487



表5 病例組與對照組父母等位基因頻率的比較（1） 組別 C等位基因 T等位基因 染色體總數（ 2n） T等位基因頻率（%）

對照組父母 191 197 388 50.77

病例組父母 297 399 696 58.76

注：（1）OR=1.30(1.01,1.68)；χ2=4.32,P=0.037



表6 病例、對照父母基因型組合構成比（1） 組別 TT和TT CT和TT TT和CC CT和CT CT和CC CC和CC 總計

對照組 3 30 8 27 25 4 97

病例組 19 57 10 51 30 7 174

合計 22 87 18 78 55 11 271

注：（1）χ2=7.633， P=0.178

表7 病例組和對照組后代為純合突變的概率的比較 突變頻率 病例組 對照組 OR 值 95％CI P值

0 47 37 － － －

0.25 51 27 1.49 0.75-2.95 0.221

0.5 57 30 1.50 0.77-2.91 0.202

1 19 3 4.99 1.25-23.03 0.009